Mouse ACE ELISA 試劑盒 EK0558
產品信息
血管緊張素I 轉化酶ELISA 試劑盒
產品編號：EK0558
規格： 96T
檢測范圍：93.8pg/mlf 6ng/ml。
敏感性： <10pg/ml
特異性： 系統和其它細胞因子無交叉反應。
保存： 2-8℃ (頻繁使用時) ；-20℃ (長時間不用時 ) 。
有效期：6個月(4℃) ； 12個月 (-20℃) 。
用途： 用于體外定量分析鼠血清、血漿、細胞裂解液、細胞培養上清。
Angiotensin I Converting Enzyme, ACE。血管緊張素 I轉化酶，是一種鋅金屬肽酶，對水和 鹽的代謝及維持血壓起重要作用。它切除血管緊張素I的C端二肽，產生具有升壓活性的 血管緊張素II。同樣的機制滅活緩激肽(brandykinin),此外還通過類似的機制在免疫、生 育、神經調節方面發揮作用?？扇苄?ACE來源于膜型ACE存在于血、羊水、腦脊液等多 種體液。
博士德所提供的小鼠ACE ELISA Kit是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定試劑盒(Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay, ELISA)。預先包被的抗體和檢測相抗體都是近99%純度的 親和純化多克隆抗體。檢測相抗體經 (biotin)標記。樣品和標記抗體先后加 入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經過PBS 或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸 的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ACE呈正相關。
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● 操作及儲存/ Content and storage
需要而未提供的試劑和器材
1 .標準規格酶標儀。
2 .自動洗板機。
3,恒溫箱
4 .系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器。
5 .干凈的試管和Eppendof管。
6 .用去離子水將25X洗滌緩沖液稀釋25倍，成1X洗滌緩沖液。
注意事項
1 .使用前TMB顯色液應為無色透明溶液，若發現顏色異常，請及時與廠家聯系。
2 .用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。
3 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活。
4 .為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。
5 .禁止混用不同批次試劑盒內的試劑。
6 .本公司提供的96孔酶標板是單條可拆型酶標板，用戶可按需求使用；剩余的酶標板請 按保存條件貯存。
7 .揭封板膜和覆蓋封板膜時應避免用力過大導致液體濺出。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水 紙，酶標板朝下用力拍幾次；將1X洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據 需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
樣品的準備和保存
樣品如果不立即分析，應分裝后冷凍保存，且避免反復凍融。
細胞培養上清一一離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
血清一一用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時，離心1000Xg 15分鐘，收集血清。立即 分析或分裝后-20℃冷凍保存。
血漿一一用干凈試管收集肝素抗凝血液，30分鐘內離心，1000Xg 15分鐘，收集血漿。立 即分析或分裝后-20℃冷凍保存。EDTA或檸檬酸鹽抗凝血不適合。
細胞裂解液一一對于貼壁細胞，去除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。 加入適量裂解液，用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常10 秒后，細胞就會被裂 解。對于懸浮細胞，離心收集細胞，用PBS、 生理鹽水或無血清培養液洗一遍。加入適量 裂解液，用槍吹打把細胞吹散，用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后， 10000—14000g 離心3-5分鐘，取上清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
試劑的準備和保存
A. ACE標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內準備。
試劑盒提供2管標準品，每管10ng,每次使用1管。
1, 配制10,000pg/ml標準品：取1ml樣品稀釋液加入標準品管內，蓋好后靜置10分鐘以 上，然后反復顛倒/搓動以助溶解。
2, 配制6000pg/ml標準品：取0.6ml 10,000pg/ml的標準品加入有0.4ml樣品稀釋液的
Eppendorf管中，混勻，做上標記。
3,配制3000pg/mlf 93.8pg/ml標準品：準備6只Eppendorf管，每管加0.3ml樣品稀釋 液，分別標記上 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 。 取0.3ml 6000pg/ml的標準品加入標記3000pg/ml的管中，混勻后同樣取出0.3ml ,加入 下一只管中。余同此類推，直到只樣品管。
注意：已經稀釋的標準品（10,000pg/ml）,應在12小時內使用。-20℃冷凍保存條件 下，2天內可以使用，但不得反復凍融。
1 .標記抗小鼠ACE抗體工作液的準備：在使用前2小時內準備。
1 .根據每孔需要100ul計算總的用量（實際配制時應多配制100ul-200ul）。
2 .按1ul標記抗小鼠ACE加抗體稀釋液99ul的比例配制工作液。輕輕混勻。
C.親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內準備。
1 .根據每孔需要100ul計算總的用量（實配時應多配制100ul-200ul）。
2 .按1ul親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液99ul的比例配制工作液。輕 輕混勻。
操作程序
己稀釋好的ABC和TMB顯色液在加入酶標板孔前都應預先在37℃中平衡至少30分鐘。 試劑或樣品稀釋時，切不可忘記混勻 。每次檢測都應該做標準曲線。用戶須估計樣品待測 因子的含量，決定適當的稀釋倍數。
1 .確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目，并增加1孔作為TMB空白顯色 孔?？倲?樣品數+9；做雙份檢測時又2。其余重包裝好放入冰箱中。
2 . 將 6000pg/ml , 3000pg/ml, 1500pg/ml, 750pg/ml, 375pg/ml, 187.5pg/ml, 93.8pg/ml 的
標準品各100ul依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于血清、 血漿、細胞裂解液或細胞培養上清，每孔加100ul已用樣品稀釋液稀釋的樣品。
1 .酶標板加上封板膜，37。。反應90分鐘。
2 .反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體；或甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾 下。不洗。
3 .將準備好的抗小鼠ACE抗體工作液按每孔100ul依次加入。（TMB空白顯色孔 除外）。酶標板加上封板膜，37℃反應60分鐘。
4 . 1X洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右（每孔洗液至少300ul）。
5 .將準備好的ABC工作液按每孔100ul依次加入（TMB空白顯色孔除外）。酶標板加封 板膜，37℃反應30分鐘。
6 . 1X洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右（每孔洗液至少300ul）。
7 .按每孔90ul依次加入已在37℃平衡30分鐘的TMB顯色液，37℃避光反應15-20分 鐘（注意：顯色時間供參考，因用戶實驗室條件差異，顯色時間會有所不同。此 時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯）。
8 .按每孔100ul依次加入終止液，此時藍色立轉黃色。
9 .用酶標儀在450nm測定O.D.值。
有兩種設定空白對照的方案：
（1）將TMB空白顯色孔（只加TMB顯色液和終止液）設為對照。所有的標準品和樣 品的吸光值減去TMB空白顯色孔的吸光值后，在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為 縱坐標，以濃度作為橫坐標。
（2）將零孔設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后，得到的數 據可以直接在坐標紙上畫出曲線。
12.根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。
應記住由于樣品稀釋了 N倍，其實際濃度應該XN。
操作程序總結：
1 .加樣品和標準品，37℃反應90分鐘。不洗。
2 .加標記抗體，37℃反應60分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌3次。
3 .加ABC, 37℃反應30分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌5次。
4 . TMB37℃反應 15-20 分鐘。
5 .加入終止液，讀數。
典型數據
TMB37℃反應15分鐘。
（數據供參考，不同用戶顯色時間會有所不同）
| 濃度 | 0.0pg/ml | 93.8pg/ml | 187.5pg/ml | 375pg/ml | 750pg/ml | 1500pg/ml | 3000pg/ml | 6000pg/ml |
| O.D. | 0.088 | 0.169 | 0.230 | 0.315 | 0.498 | 0.942 | 1.447 | 2.178 |
