cAMP ELISA Kit（中文）

Monoclonal Anti-cAMP Antibody Based
Direct cAMP ELISA Kit
(New Non-acetylated Version)
Catalog No. 80203
96 Well Kit

產品介紹
    (腺苷-3’，5’-環化一磷酸，cAMP)能調節各種生理功能，如生物學心血管功能、 學習和記憶、 嗅覺、 免疫反應、哮喘及腎功能(1,2)。cAMP是磷酸二酯酶刺激激活腺苷酸環化酶催化ATP環化形成的，激活或抑制磷酸二酯酶能使cAMP的濃度提高。激活受體的腺苷酸環化酶的阻斷劑和cAMP的特定磷酸二酯酶的抑制劑，廣泛用于人類疾病。例如，阻斷cAMP的運行，使得β-類腎上腺激素受體增加而用于治療心率不齊、高血壓、心肌埂塞和心力衰竭。針對cAMP的特定Ⅱ型和Ⅳ 型腺苷酸環化酶的抑制劑，正在進行增強認知方面的臨床測試。因此為篩選出腺苷酸環化酶激活劑或磷酸二酯酶抑制劑，需要一個高敏感度、特異性的、可重復的方案用于檢測 cAMP的濃度。

目前商業化提供的一些cAMP檢測試劑盒主要應用ELISA的方案，使用的是非親和純化的cAMP多克隆抗體，盡管具有靈敏性，這些多克隆抗體與ATP存在一定程度的交叉反應?；贏TP是cAMP生產的底物，很有必要找到一種能高特異性識別cAMP的抗體。
紐斯特生物開發出了的鼠單克隆抗體的cAMP ELISA 檢測試劑盒。該單克隆抗體對cAMP的特異性比cAMP、ATP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體cAMP試劑盒，紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性，且能有效避免來自動物多克隆抗體的批次間差異， 因此可以提供長久有效地可重復性定量檢測。
此外，其他ELISA試劑盒的多克隆抗cAMP抗體與乙酰化cAMP的親和力明顯高于非乙?；痗AMP，本試劑盒的單克隆cAMP抗體與乙?；蚍且阴；痗AMP具有同樣的親和力 。因此，紐斯特生物cAMP ELISA試劑盒中的樣品和標準品不需要乙?；幚?，從而明顯縮短了分析時間

，有效避免了乙?；^程中的有機試劑的使用，為大家提供了一個更安全、更健康的工作環境。

實驗原理
   本試劑盒利用競爭酶聯免疫分析方法來測定細胞提取物或體外腺苷酸環化酶實驗中的cAMP的水平。簡而言之，將羊抗鼠多克隆抗體包被在酶標板上，細胞提取物或體外腺苷酸環化酶實驗中的cAMP與固定數量的偶聯辣根過氧化物酶的cAMP或堿性磷酸酶競爭性的結合抗cAMP單克隆抗體，已知的cAMP作為標準品來做標準曲線。經過一段時間孵育，洗掉所有試劑，加入底物進行顯色。將多孔板置于酶標儀上，于450nm或405nm波長下，進行讀數。黃色的光強度與樣品中cAMP的濃度呈反比關系?；赾AMP標準品所得曲線，通過測得的光密度可以計算出樣品中cAMP的濃度。

研究背景
  cAMP作為的第二信使，可調節細胞對各種外源和內源信號分子的反應。 它主要通過激活蛋白激酶、控制特定的離子通道、磷酸二酯酶調節細胞環核苷酸濃度以及激活Epac(通過cAMP直接激活蛋白交換)(3-6)來調節生理過程。通過腺苷酸環化酶可以實現ATP轉化為cAMP。 哺乳動物體內的主要腺苷酸環化酶家族均是橫跨膜的，具有9個亞型，且可通過G蛋白Gs或鈣離子/鈣調素(1)激活。另外，還有一種可溶性的腺苷酸環化酶，可以通過碳酸鹽或Ca2 +調節(7)。

試劑盒組成材料和試劑
1. 羊抗小鼠IgG包被的96孔微孔板一張 catalog No.30101
該微孔板將特異性識別小鼠IgG 的山羊抗體包被于可拆分酶標條上。
2. cAMP偶聯的辣根過氧化物酶工作液6 mL catalog No. 30102
本包裝含1000×偶聯酶儲存液和稀釋緩沖液。
3. 抗cAMP的小鼠單克隆抗體工作液6 mL catalog No. 26002-2
本包裝含1000×抗體儲存液和稀釋緩沖液。
注意：為了穩定和長效的實驗，抗體儲存于-80℃。在使用前將6μL 1000×偶聯酶儲存液加入到6 mL 稀釋緩沖液中配制為工作液，并輕輕混勻。工作液請避免反復凍融。
4. 中和液6 mL catalog No. 30103
5. 10×濃縮洗滌液15 mL catalog No. 30103
含去污劑的磷酸鹽緩沖液。
6. cAMP標準品0.25 mL catalog No. 30203
濃度5000 pmol/ mL
7. 顯色底物A，12 mL catalog No. 30107
8. 顯色底物B, 12 mL。 catalog No. 30108
9. 終止液，6 mL； catalog No. 30110
注意：該溶液有腐蝕性；儲存時請旋緊瓶蓋

試劑盒儲存要求
本試劑盒所有組分在有效期限內，于4℃穩定保存。為了長效的實驗，1000×儲液請保存于-80℃。本試劑盒未提供的必需試劑
1. 去離子水或蒸餾水。
2. 濃鹽酸。
3. 量程在5μL至1000μL之間的精密移液管。
4. 量程為50μL和200μL的中繼移液器。
5. 用于稀釋儲液的一次性燒杯。
6. 刻度量筒。
7. 微孔板振蕩器。
8. 吸水紙。
9. 酶標儀，可讀波長450nm，在570nm至590nm之間應有修正。

樣品處理
  紐斯特生物的ELISA試劑盒適用于檢測經過鹽酸處理而終止內源性磷酸二酯酶活性的cAMP樣品。這種樣品可直接應用于檢測，而不需要蒸發和進一步的處理。
組織樣本需預先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細粉末。待液氮揮發完后，稱量冰凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心，取上層清夜用0.1M HCl稀釋至適當濃度。
對于生長的組織培養液中的細胞，首先移除培養基，然后加入0.1M HCl處理細胞。孵育10分鐘并觀察細胞是否被裂解；如果裂解不充分，接著孵育10分鐘并觀察。以大于600g離心力于室溫離心，收集上清直接用于實驗。臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強細胞和組織裂解。在這個濃度范圍內，去污劑并不干擾試驗的結合部位，但是會適度的增加光密度值。含有Triton的樣品需利用標準曲線估計濃度，為了確的測定，標準曲線需以相同方式稀釋。取1 mL細胞培養上清加入10μL濃鹽酸，600g離心力于室溫離心，上清液直接用于實驗測定分析。

注意步驟
1. 在使用前，將所有試劑放置30分鐘，平衡至室溫。
2. 用試劑預先潤洗槍頭在使用；取各種樣品、標準品和試劑必需更換槍頭。
3. 移取標準品和樣品到微孔底部。
4. 從微孔的邊緣加入試劑，以避免污染。
5. 本試劑盒使用可拆分的微孔酶標條，使用者可根據樣品量多少進行拆分。未使用的酶標條保持干燥，密封于試劑盒提供的鋁封袋中，于4℃保存。微孔酶標條需安裝在相應的框架上使用。
6. 在加入顯色底物前，確保微孔內沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導致分析結果的變化。

試劑準備
1. 非乙?；痗AMP標準品

將5000 pmol/mL cAMP標準品溶液平衡至室溫。從#1至#6標記六只潔凈試管。移取475μL 0.1M HCl到#1號試管，400μL到#2至#6號試管。加入25μL 5000 pmol/mL cAMP標準品到#1管中，劇烈渦旋震蕩。從#1管中取出100μL溶液至#2管中，渦旋震蕩。以此類推，重復上步操作，梯度稀釋至#6管。
經以上操作，#1至#6管中cAMP標準品濃度分別為250,50，10,2,0.4和0.08 pmol/mL（詳見cAMP實驗稀釋詳情鍵盤紙）。稀釋過的標準品需在30分鐘內使用。
標記一只試管作為無標準品空白對照（NSB）。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。
2. 洗滌液
將15 mL 10×洗滌液儲液加到135 mL去離子水中，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限，或者3個月。

實驗步驟
使用前將各種試劑取出放置30分鐘，平衡至室溫。所有標準品和樣品必需設置平行對照實驗。
快速加入試劑至樣品中，立即漩渦震蕩2秒混勻。
1. 依據實驗鍵盤紙決定酶標條的使用量，將剩余的酶標條連同干燥劑一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。
2. 移取50μL中和液至各個微孔中，除了TA(全活性)孔和Blank(空白)孔。
3. 移取100μL 0.1M HCl至NSB(非特異結合)孔和B0孔(0 pmol/mL cAMP標準品)。
4. 移取100μL cAMP標準品至相應的孔。
5. 移取100μL樣品至相應的孔。
6. 移取50μL 0.1M HCl至NSB(非特異結合)孔。7. 移取50μL 偶聯酶至各孔中，除了TA(全活性)孔和Blank(空白)孔。
8. 移取50μL 抗體工作液至各孔中，除了TA(全活性)孔、Blank(空白)孔和NSB(非特異結合)孔。
9. 將酶標孔置于孔板振動器上，250~500rpm，室溫孵育2小時。
10. 在吸水紙上拍干微孔內溶液，加洗滌液400μL每孔洗3次，每次需拍干。
11. 次洗滌，清空各微孔，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標板數次，以確保沒有洗滌液殘留。
12. 加5μL 偶聯酶至TA(全活性)孔。
13. 每孔200μL顯色底物溶液，于室溫靜置5~30分鐘。（顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內等體積混合，并避光放置。）
14. 每孔加入50μL終止液。終止后立即讀數。
15. 清除酶標儀Blank(空白)孔值，讀取450nm處的光密度值，在570nm至590nm之間有修正。如果酶標儀不能自動清除Blank(空白)孔值，那么手動扣除每個讀數的Blank(空白)孔光密度值。

結果計算
樣品中cAMP濃度有多種計算方法。X軸表示cAMP標準品濃度，Y軸表示凈光密度的平均值或者百分比值。
1 樣品和標準品的凈光密度(OD)平均值的計算：
凈OD平均值 = OD平均值 － NSB孔OD平均值
2 計算不同梯度濃度標準品的結合率占結合率(B0孔)的百分比，計算公式 如下：
百分比值 = (凈OD平均值/ B0孔OD平均值)×100
3 繪制凈OD平均值或百分比值對cAMP標準品濃度的Logit-Log曲線。通過插值即可得到樣品中cAMP濃度。

標準曲線
下面的曲線不能用于計算cAMP濃度。每次實驗需新做一條標準曲線。

靈敏度
通過比較10個B0孔平均光密度值(OD)和10個5號管標準品的平均光密度值，計算出靈敏度。cAMP濃度的檢測極限通過標準曲線上0位置的兩個標準偏差來測定。
OD(B0平均數) =0.685± 0.003
OD（5號 標準品平均數）=0.604± 0.010
光密度偏差(0-0.4 pmol/mL) =0.081
2 SD's of the Zero Standard =0.006
靈敏度 =081.0006.0/0.8×0.4 pmol/mL =29.6 fmol/mL
線性關系
cAMP濃度為16.0pmol/mL的樣品，用0.1M HCl進行連續七次1:2梯度稀釋。將實際的cAMP濃度和測定的cAMP濃度繪制圖表。該直線的斜率為1.000，相關系數為0.999。
交叉反應
部分相關化合物的交叉反應由競爭ELISA測定。將可能的交叉反應物溶解到試劑盒分析緩沖液中，濃度從500pmol/mL至500,000pmol/mL。這些樣品通過乙?；赾AMP競爭分析中被測定，通過比較樣品中交叉試劑的實際濃度，可以計算出交叉反應，并用百分比(%)表示。