谷研試劑-動物組織切片原位雜交的改進技術

一、所需試劑

*（使用時用3%的檸檬酸稀釋），原位雜交預雜交液，封閉液，，*化抗，*化過氧化酶，松脂油，氯化鈉，十二水合*，二水合*，鏈霉親和素-*復合物(streptavidin-biotincomplex，SABC）4%多聚甲醛，檸檬酸三鈉，丙三醇，二甲苯，DEPC水，3%過氧化氫酶溶液。

二、所需器皿

原位雜交蓋玻片，37度或53度恒溫孵育箱，60度烤箱，吹風機，孵育保濕盒等。

三、實驗操作

1、從將動物解剖后所獲得的組織一般是經過石蠟包埋制成臨床組織切片，故應先去掉包埋在組織表面的石蠟，將切片放至60度烤箱烘烤1h，一小時后，將切片趁熱放至松脂油內，在松脂油內放置10min×2次，以溶解切片組織表面的石蠟。

2、切片從松脂油內取出后分別在*，90%，70%，50%的酒精內各浸泡5min×2次（按照酒精濃度依次降低的順序進行漂洗），以洗掉殘留在組織表面的松脂油。

3、不同濃度的酒精浸泡完之后，再將切片放在3%過氧化氫酶溶液中浸泡10min，DEPC水漂洗5min×3次。

4、用吸水濾紙將切片組織附近的水分吸干，但是注意不能碰著組織以免破壞組織，在組織表面滴加數滴4%多聚甲醛（以*覆蓋組織為準），將切片放至孵育保濕盒內（盒內放入水和丙三醇以體積比1:1的混合液，以保持盒內的濕潤環境）在室溫固定15min，DEPC水漂洗5min×3次。

5、吸水濾紙吸干后在組織上滴加原位雜交預雜交液（亦是以*覆蓋組織為準），此時要注意自己所要檢測的是基因探針還是miRNA探針，基因探針的孵育溫度是37度，RNA探針的孵育溫度是53度，孵育保濕盒內孵育4h。

6、孵育完預雜交液之后即要孵育探針雜交液，條件同預雜交液一致，孵育保濕盒內孵育過夜（雜交時間不能少于16個小時）。

7、將切片取出后放在提前預熱好（預熱至37度）的2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC溶液內各漂洗5min（2×SSC配方：100mL水中將加入氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉8.8g，0.5×SSC及0.2×SSC溶液用2×SSC以相應比例稀釋即可）。

8、吸水濾紙吸干SSC溶液，向組織表面滴加原位雜交封閉液，室溫孵育30min。

9、向組織表面滴加溶液（用于標記核酸探針），37度孵育箱內孵育2h，取出后用1×PBS漂洗5min×4次（原位雜交5×PBS配方：850mL水中加入氯化鈉120g，十二水合*24g，二水合*1.6g）。

10、向組織表面滴加SABC溶液，37度孵育30min，取出后1×PBS漂洗5min×4次。

11、向組織表面滴加*化過氧化物酶，37度孵育30min，取出后1×PBS漂洗5min×4次。

12、配制DAB顯色液：在850uL水中按順序分別加入A，B，C試劑各50uL。配制好的DAB顯色液要避光保存，且在30min內有顯色效果，因此要現用現配。DAB顯色時間為室溫下2min即可，染色結果為棕色。DAB染色后用DEPC水清清漂洗5min。

13、蘇木素染核室溫4min，然后用預熱好的溫水（37度）漂洗5min。

14、依次用70%，90%，*的酒精溶液分別漂洗5min，（注意：此時用酒精漂洗的目的是使組織脫水，故按酒精濃度照依次升高的順序進行漂洗，若脫水不好會使組織成片渾濁，不利于觀察拍照；而之前為了洗去殘留的松脂油則按照酒精濃度照依次降低的順序進行漂洗。）

15、將切片放至通風櫥內的二甲苯內浸泡2min（二甲苯浸泡的目的是出組織表面的有機雜質，使切片變得透明清晰），并在通風櫥內用吹風機吹干（注意：1、二甲苯有毒，操作時需帶口罩；2、用吹風機吹干時，調解吹風機檔位使風的溫度不能太高，以防止將組織灼燒破壞。）

16、在吹干的組織上滴加一小滴中性樹膠油，將蓋玻片輕輕放在樹膠油上，以免產生氣泡。

17、在電子顯微鏡下觀察拍照，拍照時一張切片要同時在20倍和40倍視野下分別拍照，而且40倍視野要在20倍視野范圍內拍攝。

觀察結束后將切片常溫或4度保存即可。