擬南芥原生質體制備轉化方法

擬南芥原生質體制備轉化方法

實驗試劑

1. 纖維素酶解液：

2. PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是現用現配，每個樣品需100μl PEG4000溶液，可根據實驗樣品量調整溶液配置總量）

3. W5 溶液

4. MMG溶液

5. WI溶液

實驗步驟

1. 土培室播種種植擬南芥。

2. 生長良好情況下在未開花前用于取材葉片制備原生質體。

3. 剪取中部生長良好的葉片用刀片切成0.5 -1 mm寬的葉條。

4. 將切好葉條擲入預先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大約需10-20片葉子）。并用鑷子幫助使葉子*浸入酶解液。

5. 用真空泵于黑暗中抽30分鐘。（此時可配制PEG4000溶液，200和1000 ul槍頭去尖使操作時吸打緩和。）

6. 在室溫中無須搖動繼續黑暗條件下酶解至少3個小時。當酶解液變綠時輕輕搖晃培養皿促使原生質體釋放出來。（此時預冷一定量W5溶液）

7. 顯微鏡下檢查溶液中的原生質體，擬南芥葉肉原生質體大小大約30-50 um。

8. 在過濾除去未溶解的葉片前用等量的W5溶液稀釋含有原生質體的酶液。

9. 先用W5溶液潤濕35-75 um的尼龍膜或60-100目篩子，然后用它過濾含有原生質體的酶解液。

10. 用30毫升的圓底離心管100g，1-2分鐘離心沉淀原生質體。盡量去除上清然后用10ml 冰上預冷的W5溶液輕柔重懸原生質體。

11. 在冰上靜至原生質體30分鐘。

以下操作在室溫23℃下進行

12. 100g離心八至十分鐘使原生質體沉淀在管底。在不碰觸原生質體沉淀的情況下盡量去除W5溶液。然后用適量MMG溶液（1m）重懸原生質體，使之zui終濃度在2X10⁵個/ml。

13. 加入10 ul DNA（10-20微克約5-10kb的質粒DNA）至2ml離心管中。

14. 加入100 ul原生質體（2x10⁴個），輕柔混合。

15. 加入110 ul PEG溶液，輕柔拍打離心管*混合（每次大約可以轉化6-10個樣品）。

16. 誘導轉化混合物5-15分鐘（轉化時間視實驗情況而定，要表達量更高也許需要更高轉化時間）。

17. 室溫下用400-440 ul W5溶液稀釋轉化混合液，然后輕柔顛倒搖動離心管使之混合完好以終止轉化反應。

18. 室溫下用臺式離心機100g離心2分鐘然后去除上清。再加入1ml W5溶液懸浮清洗一次，100g離心兩分鐘去上清。

19. 用1ml WI溶液輕柔重懸原生質體于多孔組織培養皿中。

20. 室溫下（20-25℃）誘導原生質體18小時以上。

21. 激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP標簽表達。

（以上實驗可以根據自己實驗情況適當調整）