腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性試劑盒

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性試劑盒
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性測定試劑盒說明書

分光光度法 25 管/24 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與 ATP 反應生成淀粉合成的直接前體 ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。
腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性試劑盒測定原理

AGP 催化的逆向反應生成 G1P，在反應體系中添加的磷酸己糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下測定 NADPH 增加速率，即可計算

AGP 活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制

提取液：液體 30mL×1 瓶，4℃保存;
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，4℃保存；臨用前加入 250μL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 2mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
試劑五：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 3mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 250μL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
試劑七：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 250μL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

粗酶液制備

按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、試劑一置 30℃保溫 10min 以上。

2、在 EP 管中按順序加入下列試劑（如果一次性測定樣本較多，可以將試劑一、二、三和四按比例配成混合液 1，將試劑一、五、六和七按比例配成混合液 2）

試劑名稱（μL）    測定管
    
試劑一    100
    
試劑二    10
試劑三    50
試劑四    100
樣本    20

混勻，30℃保溫 15 min，置沸水浴中 1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴迅速冷卻

試劑一    300
試劑五    100
試劑六    10
試劑七    10

混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2，計算 ΔA=A2-A1。

AGP 活性計算

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性試劑盒1、按樣本蛋白蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活性單位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產生 1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

AGP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T

=2813×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，7×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數，6.22×103mol/L/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。