磷超標是造成水體富營養化的主要原因之一.研究發現，當總磷濃度超過0.1mg·L-1(磷作為限制因素，mTN∶mTP>15∶1)，藻類會過度繁殖;一般情況下，總磷濃度超過0.02mg·L-1就有可能導致水體富營養化.由于水體富營養化現象日趨嚴重，嚴重破壞了人類賴以生存的自然環境，威脅著人類的健康.常規的生化處理工藝效率低，不能從根本上解決問題.近些年，微生物除磷工藝的研究得到了迅速發展，主要有A/O、A2/O、UCT、五段Bardenpho、Phostrip等.為實現微生物除磷工藝的有效實施，篩選出除磷能力較強的聚磷微生物是首要目標.此外，考慮到聚磷微生物對磷的吸收是一個厭氧釋磷、好氧吸磷的過程，有必要考察聚磷微生物對溶氧的響應.同時，微生物聚磷過程會受有機質分子大小、pH等的影響.因此，考察特定微生物在不同理化條件下的生長情況和除磷特性是實現微生物除磷機理研究及其在工程應用的前提條件.
為獲得除磷能力較強的微生物種質資源，自聚磷菌被分離以來，至今已有多種具備聚磷能力的微生物被篩選出來.多項研究表明，產堿桿菌屬細菌(Alcaligenessp.)具備這方面的能力.此外，腸桿菌(Enterobacteriaceae)、*(Staphyloccocus)Accumulibacter、變形菌(Alphaprotenbacteria)等也是常見的聚磷微生物，甚至存在兼具反硝化功能的聚磷微生物.在此基礎上，人們又開展了大量關于溶氧對聚磷菌除磷能力的影響研究，但這些研究較少涉及不同聚磷菌在不同的厭氧時間條件下對好氧吸磷的相關作用.此外，諸如pH和有機質分子大小等理化因素對聚磷菌聚磷能力的影響也已得到較深入研究.然而，當前的多數研究只局限于對單一因素的考察，抑或集中于研究高濃度廢水的生物處理系統，目前，聚磷微生物除磷工藝離工程應用仍有較大的距離.正如研究表明，微生物的固定化能夠為其活性持留提供保障.然而，考察固定化聚磷菌對含磷廢水的修復實驗尚未見相關報道.因此，繼續篩選和開發具備除磷功能的微生物，開展聚磷微生物的固定化、活性持留及污水修復并開展綜合理化因素對聚磷微生物除磷能力的影響等方面的研究對工程實踐有重要指導意義.
鑒于此，本研究從排污口淤泥中篩選出1株具備除磷能力的聚磷菌，全面考察各理化因素對菌株生長及除磷能力的影響.同時，對微生物進行固定化，并重點考察其對含磷廢水的凈化效果.
2材料與方法
2.1材料
2.1.1樣品來源
淤泥樣品采自福州市閩侯縣上街鎮高岐村某排污口，立即用于菌種的分離與篩選.
2.1.2培養基
富集培養基、篩選培養基、微量元素，以及缺磷培養基和富磷培養基分別按文獻進行配制.LB培養基(g·L-1)：蛋白胨10.00，酵母粉5.00，NaCl10.00，瓊脂2.00(固基加入)，pH=7.2.固定化微生物小球實驗培養基(g·L-1)：丁二酸鈉0.61，NaNO30.28，KH2PO40.1，KCl0.014，MgSO4·7H2O0.02，CaCl2·2H2O0.018，pH=7.2.
以上所有培養基均經121℃滅菌(碳源實驗中，葡萄糖和蔗糖組115℃滅菌)20min后使用，微量元素于滅菌前加入.
2.1.3微生物固定化小球制備材料
*(Polyvinylalcohol，PVA)、海藻酸鹽(Sodiumalginate，SA)、硼酸(H3BO3)、無水氯化鈣(CaCl2)，除硼酸(分析純)外其余均為化學純.
2.2方法
2.2.1聚磷菌的分離鑒定
稱取0.5g新鮮淤泥，用無菌水水洗后8000r·min-1離心5min，棄上清，此過程重復3次.處理后將樣品加入2.1.2節的富集培養基中，添加量及其他條件參考文獻.培養12h后，取1.5mL菌懸液于下一磷梯度的培養基中，磷梯度依次為2、5、8、10、15和20mg·L-1(以P計).
聚磷菌含有典型的PHB顆粒和異染顆粒，經強化釋磷、吸磷實驗后，PHB顆?？杀恢苄匀玖咸K丹黑著色，異染顆?？杀患妆桨匪{和次甲基藍染成紫色，可與其他非顆粒性物質區分開來.將富集馴化的菌懸液按10-1~10-7梯度進行稀釋，涂布平板.挑取形態較特殊的單菌落進行PHB顆粒染色和異染顆粒染色，確定含有PHB顆粒和異染顆粒的菌落，進行復篩實驗.
挑取經純化的單菌落于缺磷培養基中，150r·min-1、30℃培養12h.將菌液在8000r·min-1條件下離心5min，再將菌液轉接于富磷培養基中，150r·min-1、30℃培養至菌液變渾濁.計算各株菌的除磷率.此后，將復篩得到的聚磷菌根據文獻的方法進行16SrRNA的測序及系統發育分析.
2.2.2理化因素對聚磷菌生長及除磷特性的影響
聚磷菌具備除磷能力主要基于異染顆粒對磷的貯存，菌體在生長過程中也能夠利用部分磷合成細胞成分.文獻報道顯示，聚磷菌在厭氧、缺磷條件下能夠把貯存于異染顆粒中的磷釋放出來，經厭氧釋磷后將其投入富磷培養基中進行除磷實驗能夠大大提高除磷能力.此外，碳源、氮源、C/N、pH、溫度等都會影響聚磷菌的生長.因此，考察不同理化因素對聚磷菌生長及除磷能力的影響是必要的，這對實現聚磷菌的工程應用有重要參考價值.
將菌株ED-12于LB培養基中培養12h(30℃、150r·min-1)，按5%的接種量接種于裝有30mL缺磷培養基(PO3-4-P質量濃度為12.3mg·L-1)的150mL三角瓶中，30℃、150r·min-1搖瓶培養12h;再按5%的接種量將菌懸液接種于裝有30mL富磷培養基(PO3-4-P質量濃度為32mg·L-1)的150mL三角瓶中，30℃、150r·min-1搖瓶培養.每隔一定的時間取樣測定菌株ED-12的OD600及剩余的PO3-4-P濃度，計算除磷率并繪制菌株的生長曲線圖.
以聚磷菌的生長特性為基礎，以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源，以NH4Cl、(NH4)2SO4和NH4NO3為*氮源，同時考察了不同C/N、起始pH和搖床轉速對聚磷菌生長及除磷能力的影響.在優化過程中，已優化的參數作為后續實驗的條件.此外，在*條件下，探討了菌株ED-12對不同起始濃度PO3-4-P的去除效果，以考察其工程應用價值.PO3-4-P的起始濃度梯度設置為：5、15、30、45、60和100mg·L-1.
2.2.3微生物固定化小球的制備及除氮磷初步實驗
微生物固定化小球的制備按以下步驟進行：①稱取4gPVA(聚合度1750±50)溶于90mL無菌水中，待PVA充分溶解后加入2gSA，沸水浴加熱至*溶解，冷卻至室溫備用;②分別稱取2g反硝化菌和聚磷菌濕菌體，充分稀釋于10mL無菌水中，再將稀釋后的菌液加入PVA-SA體系中，充分混勻;③根據需要的小球粒徑，剪去5mL移液槍槍頭，吸取菌體混合物，勻速滴入5%CaCl2-飽和硼酸溶液中，交聯15min后，將小球用無菌水洗凈，備用.
以不添加菌球的組別為空白對照(Blankcontrol)，以不添加微生物的固定化小球組為陽性對照(PVA+SA)，按5%(m/V，g·L-1)投加小球.24h后取樣測定水樣的TN和TP濃度，計算脫氮除磷能力.
2.3測定方法
硝態氮(NO-3)和總氮(TN)的測定采用*分光光度法，總磷(TP)的測定采用鉬銻抗分光光度法.
2.4數據處理與統計分析
運用MicrosoftExcel2003和Origin8.5進行數據處理、統計分析及繪圖.所有實驗均進行3個重復，結果以Mean±SD表示.
3結果與討論
3.1聚磷菌的分離鑒定
3.1.1聚磷菌的分離純化及復篩
經富集，聚磷微生物在平板上的菌落隨著磷濃度的升高而減少，當磷濃度達到20mg·L-1時，平板上已無單菌落.將磷濃度為15mg·L-1的培養基按10-1~10-7稀釋，涂布平板.根據形態特征，將能夠在培養基上生長的49個單菌落分成4類，分別為EA(12株)、EB(15株)、EC(8株)和ED(14株).分別對EA、EB、EC和ED進行PHB顆粒染色和異染顆粒染色，初篩得到9個染色效果較明顯的聚磷菌單菌落(EA、EB和ED各3個，EC無受染現象).
隨后，對EA、EB和ED共9株聚磷菌進行復篩實驗.分別缺磷培養12h后，轉接于富磷培養基中繼續培養24h，測定除磷率，結果如表1所示.可知，ED-12對磷的去除能力zui強，可達52.2%，因此，選擇菌株ED-12作進一步研究.
表1聚磷菌的除磷能力(起始濃度:33.9mg·L-1)
3.1.2聚磷菌菌株ED-12的16SrRNA的PCR擴增及序列分析
經測序，獲得片段長度為1463bp的部分16SrRNA基因序列，GenBank登錄號為JX966315.在NCBI數據庫的比對結果表明，該菌株與Alicaligenessp.的相似性達98%以上，推測其為Alicaligenessp.選擇序列相關性較高的76個16SrRNA序列，用CluxtalX序列分析軟件分析其與ED-12的序列同源可靠性，選9個可信度較高的序列用MEGA4.0軟件通過N-J法構建系統發育樹，確定ED-12的進化地位，結果如圖1所示.
圖1基于16SrRNA序列同源性構建的菌株ED-12和親緣性相近的其他細菌的系統發育樹
3.2ED-12的生長曲線及除磷特性
聚磷菌在缺氧、缺磷條件下會利用異染顆粒中的磷并合成PHB，將其轉入有氧、富磷的培養基后會將PHB中的能量釋放出來，以便更地聚磷，用于菌體生長并將剩余的磷儲存于異染顆粒中.圖2展示了菌株ED-12經缺磷培養后在富磷培養基中的生長情況，以及其對PO3-4-P的去除率.結果表明，在前16h，菌體生長處于延滯期，16h后進入對數期，52h后開始進入衰亡期.在整個過程中，菌體生長特征與除磷率趨勢基本吻合.64h內，磷濃度從30mg·L-1左右降低到(8.12±0.32)mg·L-1，去除率達73.82%±1.02%.此后，總磷濃度基本保持不變.
圖2菌株ED-12的生長曲線及除磷特性
3.3不同理化因素對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響3.3.1不同碳源對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
有機物特征是影響生物反應器反硝化和除磷效果的重要因素，與反硝化微生物類似，大部分聚磷菌只能以低級脂肪酸類的小分子有機基質作為碳源，并將其合成的PHB以能量形式儲存在細胞內.
以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源，菌株ED-12的生長及除磷能力結果如圖3所示，菌株ED-12在以葡萄糖和蔗糖為碳源時基本不生長，對PO3-4-P的去除率低于15%.而菌株在以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉為碳源時長勢較好，且對PO3-4-P的去除率都在50%以上.其中，以乙酸鈉為碳源時，菌株ED-12生長zui旺盛，對PO3-4-P的去除率達到了70%以上.對比5種碳源結構與分子量，相對而言，在分子結構簡單、分子量低的情況下，聚磷菌的生長較好，且能達到一個較高的除磷率，這與前述觀點相符.此外，聚磷菌對不同碳源的利用效果可能還與其本身對碳源的親和性或其他特性有關.
圖3不同碳源對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
3.3.2不同氮源對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
氮源是微生物細胞生長的第二大營養物質，對蛋白質、核酸和其他一些成分的合成非常重要.多數細菌能以氨鹽作為*氮源，由圖4可知，在以NH4Cl、(NH4)2SO4和NH4NO3為*氮源的培養基中，聚磷菌能夠良好生長.其中，在含有NH4Cl的培養基中OD600可在24h內達到1.4左右.同時，在以上3種氮源培養基中，菌株ED-12對PO3-4-P的去除率都在45%以上(NH4Cl培養基zui高，可達80%).觀察發現，菌株ED-12在24h時，在以NaNO3和NaNO2為*氮源的培養基中只能微弱的生長，但經48h的培養后，開始進入對數期，并能達到較高的OD600.此外，雖然以NaNO3和NaNO2為*氮源時微生物生長情況較差，但培養基中PO3-4-P濃度分別降低了63.72%±5.57%和34.84%±2.11%，說明微生物在24h內主要通過分解PHB并將磷儲存于異染顆粒中在后期用于菌體的生長.但研究認為，NO-2的存在在有氧和無氧兩種情況下都會抑制聚磷菌對磷的吸收.圖4得出了不同的結論，其機理有待進一步研究.在以蛋白胨為*氮源的培養基中，菌株ED-12長勢較好，但蛋白胨含有含磷雜質，因而影響了PO3-4-P去除率的計算.
圖4不同氮源對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
由此可知，聚磷菌ED-12菌株能夠在以NH4Cl、NaNO3、NaNO2、(NH4)2SO4、蛋白胨和NH4NO3為*氮源的培養基中生長.根據微生物生長量、生長周期及對PO3-4-P的去除率，NH4Cl是菌株ED-12生長及發揮除磷能力的氮源.
3.3.3不同C/N對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
碳源和氮源是微生物生長的重要物質，不同微生物對碳源和氮源的需求量不同.細菌對氮源的需求量大，真菌和放線菌等對碳源的需求量大.在脫氮除磷工藝中，必須考慮C/N以實現微生物對廢水中氮、磷的有效利用.
考察C/N對聚磷菌ED-12菌株生長及除磷能力的影響，結果(圖5)表明，隨著C/N的升高，菌體生物量增大，同時對PO3-4-P的去除率也隨之提高，C/N為3∶1時達到zui大值.此后，微生物的生長及對PO3-4-P的去除率又隨著C/N的升高而緩慢降低，說明過高的C/N導致氮源不足，微生物生長也因此受到了抑制.
圖5不同C/N對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
3.3.4不同pH對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
在好氧條件下，聚磷菌能分別以醋酸和PO3-4為碳源和磷源，生成聚合態磷作為儲能物質，儲存于細胞內并伴隨著產生OH-，導致發酵液的pH值逐漸升高.其聚磷過程可用式(1)表示.
圖6不同起始pH對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
3.3.5不同溫度對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
溫度是除有機物特征外影響微生物生長的另一重要因素，但王亞宜等(2006)和姜體勝等(2007)認為，溫度不會影響聚磷菌發揮聚磷作用.
由圖7可知，隨著溫度的升高，聚磷菌ED-12菌株的生物量也增大，35℃時zui適宜ED-12菌株的生長.相應地，ED-12菌株對PO3-4-P的去除率也呈先增后減的趨勢，在35℃時達到zui大值(73.14%±1.65%).由此可知，不同溫度對聚磷菌ED-12菌株除磷效果的影響比對其生長的影響大得多.溫度對聚磷效果存在影響，這與Panswad等(2003)的研究結果相符，即35℃zui有利于聚磷菌發揮聚磷作用，過高或過低的溫度都會抑制其效果，說明不同的微生物聚磷特性存在差異.
圖7不同溫度對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
3.3.6不同搖床轉速對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
研究表明，溶氧是影響生物除磷效果的一個重要因素.為了滿足聚磷菌生物膜內對氧的需求量，加快氧的傳遞速率，增加活性生物膜的厚度，加快聚磷菌的好氧吸磷速率，必須提高液相主體中溶解氧的含量.此外，低溶氧有利于反硝化除磷，高溶氧有利于好氧吸磷(在含硝酸鹽或亞硝酸鹽培養中可以進行厭氧生長).
如圖8所示，搖床轉速在0~200r·min-1之間，菌株ED-12都能生長.當搖床轉速為50r·min-1時，菌體OD600zui高，達2.60±0.62;當搖床轉速為100r·min-1時，對PO3-4-P的去除率zui高，達59.05%±7.26%.在各培養條件下，菌體的生長與除磷率趨勢不盡相同，說明二者是彼此獨立的過程.靜置培養時，儲存于異染顆粒的磷被分解，用于菌體的生長，此時對PO3-4-P的去除率近50%，說明菌株ED-12在厭氧條件下還能將環境中的磷用于生長.好氧條件下，菌體將部分磷用于生長，并將剩余的磷儲存于異染顆粒中，因此，在轉速≥50r·min-1時也能維持一個較高的除磷率.觀察發現，搖床轉速過高未必能提高除磷率.
圖8不同搖床轉速對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
微生物固定化小球脫氮除磷實驗表明(詳見3.5節)，ED-12菌株在低溶氧與高溶氧時都存在除磷或聚磷作用，二者作用能力的強弱導致了圖8所示的結果，即高溶氧時對PO3-4-P的去除率與低溶氧時相近.當搖床轉速為100r·min-1時，培養基中的溶氧ED-12菌株對磷的反硝化去除或儲存于異染顆粒中.低溶氧和高溶氧條件下，則分別表現為對磷的生長利用和積聚.因此，對廢水中的磷的有效去除可以通過調節溶氧而實現，此過程包括生長利用和聚磷作用.
3.4菌株ED-12對不同起始濃度PO3-4-P的去除效果
聚磷菌對磷的去除包括兩條途徑：生長利用和異染顆粒貯磷.根據聚磷菌分離篩選原理，過高濃度的PO3-4-P會抑制聚磷菌的生長與繁殖.因此，考察不同起始濃度的PO3-4-P對聚磷菌生長的影響及相應條件下聚磷菌對PO3-4-P的去除效果，對分析聚磷菌生長與聚磷過程的關系及指導聚磷菌在富營養化水體中的工程應用有實際意義.
如圖9所示，隨著PO3-4-P濃度的升高，菌株ED-12的OD600呈先增后減的趨勢.當PO3-4-P濃度為45mg·L-1時，菌株ED-12的長勢，過高的PO3-4-P反而會抑制菌體的生長.這是由于微生物生長受到了基質自抑制作用，這與聚磷菌分離篩選的結論相符.觀察發現，除5mg·L-1組，隨著PO3-4-P濃度的升高，菌株ED-12對PO3-4-P的去除率與聚磷菌生物量成正相關(圖中未顯示)，但PO3-4-P的變化濃度始終呈一遞增趨勢.當PO3-4-P濃度>45mg·L-1時，培養基中出現了部分沉淀物.正如3.3.4節的結論，聚磷過程會釋放OH-，微生物生長越快，在相同的時間內產生的OH-也越多，因此，就有越多的PO3-4-P形成了沉淀，這合理地解釋了以上的現象.以上結論說明，Alcaligenessp.ED-12對磷的吸收是一個復雜的過程，在菌體生長及聚磷過程中，不僅會受理化因素尤其是pH的影響，溶液中的磷濃度也是影響聚磷菌生長與聚磷效果的一個關鍵因素.由以上分析可知，菌株ED-12對PO3-4-P的去除能力很強，在不同PO3-4-P起始濃度梯度條件下，zui高去除率可達81.02%±2.27%，此時的PO3-4-P濃度變化量為(36.46±1.02)mg·L-1.
圖9菌株ED-12對不同起始濃度PO3-4-P的去除效果
表2所示為典型的聚磷菌對不同起始濃度PO3-4-P的去除效果.由表可知，除耳葡萄球菌(Staphyloccocusauricularis)、Accumulibacter和Competibacter外，其他菌株對濃度<50mg·L-1的PO3-4-P去除效果一般.在當前所報道的產堿桿菌除磷能力實驗中，都未開展磷濃度梯度實驗;除Bao等(2007)的報道外，其余產堿桿菌菌株對濃度<30mg·L-1的PO3-4-P去除效果都低于90%.本研究所得菌株不僅在磷濃度為45mg·L-1時具有較高的去除率，當濃度高達60mg·L-1甚至100mg·L-1時還能維持較高的活性及去除率.因此，菌株ED-12是一株較理想的聚磷菌，具有廣闊的應用前景.然而，微生物聚磷過程比較復雜，今后的研究工作可圍繞定量菌株Alcaligenessp.ED-12的磷吸收在生長利用及貯存方面的比例及吸收與釋放的關系上.
表2不同微生物對磷的去除效率
微生物PO3-4-P起始濃度/
(mg·L-1)PO3-4-P去除率參考文獻
*(Staphyloccocusaureus)1065%南亞萍等，2013
耳葡萄球菌(Staphyloccocusauricularis)50>90%Choietal.,2000
腸桿菌(Enterobactersp.)10.2594.6%張培玉等，2011
Accumulibacter&Competibacter53.3>80%Oehmenetal.,2005
克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)27<80%趙海泉等，2009
約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)1065.24%連麗麗，2009
產堿桿菌(Alcaligenessp.)7.590%劉亞男等，2005
產堿桿菌(Alcaligenessp.)10>90%Baoetal.,2007
產堿桿菌(Alcaligenessp.)20.2582.3%孫夢，2011
產堿桿菌(Alcaligenessp.)28.7377.1%焦中志等，2009
產堿桿菌(Alcaligenessp.)4581%本研究
3.5固定化聚磷微生物小球除氮磷實驗
微生物的固定化是實現微生物活性持留的途徑之一，同時，固定化也有助于目標微生物的投加與回收.當前應用zui廣泛的固定化材料是*和海藻酸鹽，固定化交聯劑通常選擇2%~5%的CaCl2-飽和硼酸溶液.
根據賴子尼等(2008)的實驗配方制備的固定化聚磷微生物小球的彈性與機械強度較好，對含氮磷廢水的凈化效果表明，菌球對磷有較強的去除能力(從(19.91±1.81)mg·L-1降至(6.19±0.76)mg·L-1)，同時能夠去除一定的氮(從(215.82±35.29)mg·L-1降至(183.42±15.35)mg·L-1)(圖10a).二者的去除率分別達56.21%和15.01%(圖10b).其中，固定化材料對氮的吸附比例較小，而對磷的吸附較顯著(p<0.01)，這可能與固定化材料的表面官能團及CaCl2等對PO3-4的親和力強于NO-3有關.同時，固定化微生物(IMOs)對磷的去除效果也優于氮，說明菌株ED-12可能不具備反硝化能力，對氮的利用僅是生長所需.由PVA+SA+IMOs組與PVA+SA組比較可知(圖10b，#表示)，無論是氮還是磷，都存在顯著差異，說明固定化微生物是氮磷去除的主要貢獻者.
圖10固定化聚磷微生物小球對氮磷的去除效果
4結論
1)本研究成功從高岐村某排污口篩選出1株典型的聚磷微生物，鑒定發現其屬于產堿桿菌屬(Alcaligenessp.)細菌，將其命名為Alcaligenessp.ZGED-12.
2)研究發現，菌株ED-12能在高磷濃度下生長，16h時進入生長對數期.理化因素實驗確定了聚磷菌ED-12的zui適生長及發揮除磷能力的條件，其中，碳源、氮源和pH對其影響zui大.磷濃度實驗表明，低濃度磷不利于菌株ED-12的生長，但過高濃度反而會抑制菌體生長及發揮聚磷功能，*磷濃度為45mg·L-1.
3)本研究成功實現了聚磷微生物的固定化，該固定化小球對氮磷的去除顯示出了良好的效果，作用機理包括固定化材料對氮磷的物理化學吸附及微生物的吸收利用(或貯存).其中，微生物在這個過程中起著關鍵作用.
