豬細小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒
【產品名稱】
商品名稱：豬細小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒
Name ：Porcine Parvovirus (PPV) Probe qPCR Kit
【包裝規格】50 次/盒
【產品及特點】
豬細小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)會引起豬細小病毒病。這是一種豬繁殖
障礙病，該病主要表現為胚胎和胎兒的感染和死亡，特別是初產母豬發生死胎、畸
形胎和木乃伊胎，但母豬本身無明顯的癥狀。豬群暴發此病時常與窩仔數減少、母
豬難產和重復配種等臨床表現有關。在懷孕早期 30-50 天感染，胚胎死亡或被吸
收，使母豬不孕和不規則地反復發情，該病毒會給養豬業帶來巨大的經濟損失，因
此豬細小病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本公司開發豬細
小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2.引物和探針經過優化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據豬細小病毒 DNA 高度保守區設計，不會跟其他微生物 DNA
發生交叉反應。
5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數
量級
6.本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
7.本產品只能用于科研。
【規格及成分】
成分 包裝
2×Probe qPCR Magic Mix 500 μL（紅蓋）
熒光 PCR 專用模板稀釋液 1 mL（綠蓋）
超純水 1ml（白蓋）
豬細小病毒探針法 qPCR 引物-探針
混合液
150 μL（棕色蓋）
豬細小病毒探針法 qPCR 陽性對照
(1×10E7 拷貝/μL)
50 μL（黃蓋）
使用手冊 1 份
【運輸及保存】
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】
樣品 DNA。
【使用方法】
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污
染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原 本產品不
提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭下同）。
3.在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分
鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充
分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充
分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個樣品待提取，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備
陽性對照），和 NC（樣品制備陰性對照）?？梢匀￡栃詫φ盏?1000 倍稀釋液 10
μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為 PC。另
外用水作為 NC。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個
用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用
于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其
中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模
板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面
只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完
畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分/每管
樣品管
N+2 個
PCR 陰
性對照管
標準曲線樣品
管（1-6 管）
2×Probe qPCR Magic Mix 10 μL 10 μL 10 μL
豬細小病毒探針法 qPCR 引物-探針
混合液
3 μL 3 μL 3 μL
N+2 個待測 DNA 模板 7 μL - - 超純水 - 7 μL - 第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液
（1-6 號） - - 7 μL（1 號樣到
1 號管，2 號樣到
2 管…）
11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：
過程 溫度 時間
預變性 95℃ 10 min PCR 反應
（45 個循環）
95℃ 15sec 55℃ 30sec 72℃ 40sec（采集 FAM 通道的熒光信號）
四、數據處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值
為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度
的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于
或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等
于 35。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則
為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復實驗的 Ct 值如果大于或等于
40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
