血液淋巴細胞分離服務 實驗耗材 返回列表頁

材料

　　1. 淋巴細胞分離液 (比重1.077土0.001)。

　　2. 肝素。

　　3. 無Ca2+、Mg2+的Hanks溶液，pH7.2～7.6。

　　4. RPMI-1640培養液(含10%小牛血清)。

　　5. 其它:注射器、吸管、滴管（均為無菌）,血球計數板，水平離心機，顯微鏡等。

　　方法

　　1. 無菌抽取靜脈血2ml，去掉針頭注人含有肝素的無菌試管中搖勻，加入2ml Hanks溶液進行對倍稀釋，混勻。

　　2. 用吸管吸取稀釋血液沿試管壁緩緩加到含有2ml淋巴細胞分離液的試管中（血液:Hanks液:淋巴細胞分離液的比例為1:1:1），沿管壁流下的稀釋血液疊加在分離液之上，并與分離液形成明顯的界面。

　　3. 經水平式離心2000r/min×20min，小心取出試管。

　　4. 用平口吸管小心吸取中層呈白色霧狀的淋巴細胞層，用Hanks溶液洗滌兩次，每次離心1500r/min×10min。

　　5. 棄上清，加RPMI-1640培養液1ml混勻，取少許進行細胞計數及活力測定。

　?。?） 細胞計數: 取1滴細胞懸液置血球計數板上，靜置片刻，顯微鏡下計數四角四個大方格內的細胞數（見圖15），按下列公式計算出細胞總數。

　　四個大方格細胞總數 ×稀釋倍數×細胞懸液毫升數×104

　　細胞總數 = 4

　?。?）臺盼藍拒染法測定細胞活力: 取4份0.2%臺盼藍與1份4.25%生理鹽水混合，將臺盼藍生理鹽水溶液與細胞懸液等量混合，在3分鐘之內壓片，在光學顯微鏡下計數未染色的細胞（為活細胞）與染色細胞（染成蘭色,為死細胞），計算活細胞占細胞總數的百分數。

　　活細胞數 ×100%。

　　細胞存活率＝ 活細胞數+死細胞數

　　6. 后將淋巴細胞懸液用RPMI-1640培養液配成相應的細胞濃度備用。

　　結果

　　在回收細胞分離液上界面的總細胞中單個核細胞應占90%以上（同時細胞存活率應大于90%），其中的粒細胞占0-5%，血小板小于0.5%，紅細胞占0-7%。

　　注意事項

　　1.抽血后在2小時內使用。

　　2.注意將稀釋后的血輕輕地沿管壁鋪在聚蔗糖液面上，避免破壞其界面。

3. 在收集單個核細胞時，將吸管輕輕插入單個核細胞層，沿管壁輕輕旋轉吸取細胞。