ROS活性氧檢測服務 實驗耗材 返回列表頁

氧是生命運動過程中*的一種氣體, 人們一旦處于缺氧或者供氧不足的環境中, 就會感到憋氣的痛苦甚至死亡。所以, 自從1770 年代初英國人Joseph Priestley 發現氧以來, 氧一直被人們認為是一種對人體百益而無一害的氣體?？墒? 科學技術迅速發展起來的今天, 我們知道, 不管是空氣中的氧還是水中的溶解氧都具有較高的氧化性, 與一般的金屬鐵一樣, 處于空氣中的人體各部位都在不斷地受到氧的腐蝕而“生銹” , 當然這種腐蝕與鐵不同, 它體現在人體的細胞水平上。特別是人體各種器官隨著年齡的增大不斷地老化更是這種腐蝕“生銹”的直觀表現。1969 年McCord 與Fridovich 發現, 在生化反應過程中O2 獲得一個電子還原生成超氧自由基(O-2 ), 進而經過紅血球的分離精制后獲得O-2 的清除滅活酶, 并命名為超氧化物歧化酶(superoxide dismultase , SOD)。這一發現激發了大批的科學研究者致力于O-2 的生成過程、反應活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究, 去探索解明SOD 在生理學上的意義。同時由O-2 衍生出來的過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)、激發態氧(一重態氧或稱單線態氧,O2)也受到了人們的重視。
所謂的活性氧, 概括地說, 是指機體內或者自然環境中由氧組成, 含氧并且性質活潑的物質的總稱:主要有一種激發態的氧分子, 即一重態氧分子或稱單線態氧分子(O2);3 種含氧的自由基, 即超氧陰離子自由基(O-2 )、羥自由基(·OH)和氫過氧自由基(HO2);2 種過氧化物, 即過氧化氫(H2O2)和過氧化脂質(ROOH)以及一種含氮的氧化物(NO)等。這些物質化學反應活性強、存在壽命短, 如O2 的平均壽命為2μs 、·OH 自由基200 μs 、O-2 自由基5 s 。正是由于它們壽命短、反應活性高, 到目前為止除了H2O2 以外,其它活性氧的測定仍然是一項性難題, 還沒有特別專一有效的方法。一般情況下采用的分析方法可大體有化學反應法 、捕捉法和直接測定法。 [2] 
來源編輯
正常代謝
體內正常代謝可以產生活性氧。線粒體是活性氧的一個重要來源，活性氧族如超氧陰離子自由基（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH·）和單線態氧都是有氧代謝的副產物。在大多數細胞中超過90%的氧是在線粒體中消耗的，其中2%的氧在線粒體內膜和基質中被轉變成為氧自由基。 [3] 
體內的活性氧并不總是有害的，它對機體也有有利的一面。例如，機體內吞噬細胞在細胞膜受到刺激時，通過呼吸暴發機制，產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 是吞噬細胞發揮吞噬和殺傷作用的主要介質。但是在病理條件下，由于活性氧的產生和清除失去了正常平衡，常常會造成活性氧對人體的損傷。 [3] 
輻射
人們很早就認識到輻射可以在體內產生活性氧。人體內的水約占體重的60%，放射線初的作用就是使水輻射分解，產生H·OH·等，破壞細胞中的核酸、蛋白質等大分子，終導致輻射病。T.Herrling 等人通過電子自旋共振（electron spin resonance，ESR） 的方法發現， 體外實驗的皮膚細胞在紫外線的作用下可以產生氧自由基，并且這種輻射的效果與輻射強度和射線對皮膚的穿透作用的大小有關。 [3] 
化學因素
許多化學藥物如抗癌劑、抗生素、殺蟲劑、麻醉劑、芳香烴類等都可以誘導產生活性氧。高壓氧也可以誘導活性氧的產生。M.Chavko 和A.L.Harabin 對在5 個大氣壓下飼養的大鼠進行實驗，可以檢測到脂質和蛋白質的過氧化，同時還原型谷胱甘肽有下降的趨勢，表明有氧化損傷的存在。另外，過渡金屬離子對活性氧的形成很重要，這些離子去除電子的能力是形成和擴展許多毒性極大的活性氧反應的基礎。典型的例子就是鐵催化的Fenton 型反應，即毒性較低的過氧化氫在過渡金屬鐵存在的情況下，生成活性*的羥自由基，從而產生更大的毒害作用。 [3] 
氧化損傷編輯
對核酸的氧化損傷
DNA 的氧化損傷主要包括：一是堿基的修飾。羥基自由基可對胸腺嘧啶的5，6-雙鍵進行加成，形成胸腺嘧啶自由基。堿基的改變可導致其基團控制下的許多生化與蛋白合成過程受到破壞。二是鍵的斷裂。自由基從DNA 的戊糖奪取了氫原子，使之在C4位置形成具有未配對電子的自由基，然后，此自由基又在β-位置發生鏈的斷裂。O2也能分解核苷酸，尤其是鳥苷酸，對鳥苷、腺苷、胞苷及尿苷分解的比例為26∶13∶8∶1。受到氧化損傷后的DNA 可能會發生斷裂、突變以及對熱穩定性改變等，從而嚴重影響了遺傳信息的正常轉錄、翻譯過程。 [3] 
對蛋白質的氧化損傷
活性氧對蛋白質的作用包括修飾氨基酸，使肽鏈斷裂，形成蛋白質的交聯聚合物，改變構像和免疫原性等5 個方面。
修飾氨基酸
蛋白質分子中起關鍵作用的氨基酸成分對自由基損害特別敏感，以芳香氨基酸和含硫氨基酸為突出，不同的自由基對特定氨基酸側鏈有特殊影響，如超氧陰離子介導甲硫氨酸氧化成為甲硫氨酸亞砜，半胱氨酸氧化成為磺基丙氨酸；羥自由基可以將脂肪族氨基酸α-位置上的一個氫原子去掉；烷氧自由基和過氧自由基等中間產物可以使色氨酸氧化為犬尿氨酸、N-甲基犬尿氨酸和五羥色氨酸。 [3] 
使肽鏈斷裂
活性氧所致蛋白質肽鏈斷裂方式有2 種，一種是肽鏈水解，另一種是從α-碳原子處直接斷裂，究竟以何種方式斷裂取決于活性氧和蛋白質的類型、濃度和二者之間的反應速率。肽鍵的水解常發生在脯氨酸處，其機制為活性氧攻擊脯氨酸使之引入羰基而生成α-吡咯烷酮，經水解與其相鄰的氨基酸斷開，α-吡咯烷酮成為新的N-末端，可以進一步水解成為谷氨酰胺。肽鏈直接斷裂的方式是活性氧攻擊α-碳原子生成α-碳過氧基，后者轉化為亞氨基肽，經過弱酸水解為氨基酸和雙羧基化合物。 [3] 
形成蛋白質交聯聚合物
多種機制可以導致蛋白質的交聯和聚合。蛋白質分子中的酪氨酸可以形成二酪氨酸，半胱氨酸氧化形成二硫鍵，兩者均可以形成蛋白質的交聯。交聯可以分為分子內交聯和分子間交聯2 種形式。蛋白質分子中酪氨酸和半胱氨酸的數目可以決定交聯的形式。另外，脂質過氧化產生的丙二醛（MDA）與蛋白質氨基酸殘基反應生成烯胺，也可以造成蛋白質交聯。生物體內單糖自動氧化的α-羰醛產物可以與蛋白質交聯而使酶失活，并使膜變形性下降，導致細胞衰老與死亡。 [3] 
改變構像
蛋白質經氧化后，熱動力學上不穩定，部分三級結構打開，失去原有構像。用H2O2和抗壞血酸-Fe（III）氧化SOD，其紫外吸收增強，內源性熒光減弱，表明酶分子由緊密有序排列趨于松散無序。用自旋標記研究，探測到較低濃度抗壞血酸-Fe（III）和H2O2，就可以影響到SOD 分子亞基締合或其周圍的結構。
改變免疫原性
用H2O2，或H2O2，-Cu2+和抗壞血酸-Fe（III）體系作用于牛紅細胞銅鋅超氧化物歧化酶（SOD）， 人血清白蛋白（HAS） 和人IgG， 結果發現SOD、HAS 和IgG 與其抗體反應增強， 提示活性氧可能參與了某些自身免疫性疾病中抗原抗體復合物的形成過程。 [3] 
對生物膜的損傷
自由基對生物膜的損傷是作用于細胞膜及亞細胞器膜上的多不飽和脂肪酸，使其發生脂質過氧化反應，脂質過氧化的中間產物脂自由基（L·）、脂氧自由基（LO·）、脂過氧自由基（LOO·）可以與膜蛋白發生攫氫反應生成蛋白質自由基，使蛋白質發生聚合和交聯。另外，脂質過氧化的羰基產物（如丙二醛）也可攻擊膜蛋白分子的氨基，導致蛋白質分子內交聯和分子間交聯。另一方面自由基也可直接與膜上的酶或與受體共價結合。這些氧化損傷破壞了鑲嵌于膜系統上的許多酶和受體、離子通道的空間構型，使膜的完整性被破壞、膜流動性下降，膜脆性增加，細胞內外或細胞器內外物質和信息交換障礙，影響膜的功能與抗原特異性，導致廣泛性損傷和病變。機體中HO·大部分在細胞器中產生，特別是在線粒體中產生，造成線粒體膜的損傷，導致細胞和機體的能量代謝障礙。 [3] 
測定方法編輯
化學反應法
由于活性氧具有較高的反應活性, 它們可以與許多不同的化合物發生化學反應, 由此產生各種不同的反應生成物, 根據這些反應生成物或者反應物的變化程度可以進行定量或者定性分析。通常采用的儀器分析方法有, 化學發光法 、紫外-可見吸收分光光度法 、熒光光度法 、電子自旋探針 以及選擇性電極法等。化學反應法的特點是測定靈敏度高、廉價、操作簡便等。但是, 化學反應法的特異性相對比較差, 一些氧化還原反應或者酶催化反應往往對測定結果的判斷產生影響, 一般需要其他分析方法作為比較, 才能獲得滿意的結論。 [2] 
化學發光法
化學發光測定法是儀器分析中靈敏度高的方法之一, 已在醫學、環境以及工業分析等許多領域里得到廣泛的應用 。活性氧的化學發光研究也是活性氧測定法研究領域中比較活躍的分支之一, 特別是針對H2O2 測定, 有許多靈敏度高、選擇性好的化學發光體系 。進年來, 筆者在H2O2 測定方面開發了一系列高靈敏度的化學發光分析法。除此之外, 目前比較成功的活性氧化學發光測定法主要有魯米諾法(luminol)、光澤精法(lucigenin)和cypridina luciferin analog(CLA)法。
分光光度法
活性氧的分光光度測定, 常用的方法有細胞色素丙(cytochrome C)的超氧自由基還原法 和硝基四氮唑籃(nitro blue tetrazolium ,NBT)還原法 。具有氧化活性的細胞色素C 被·O-2 還原后, 形成了在波長550 nm 處有強吸收的亞鐵細胞色素 , 可以用于O-2 的直接測定, 在SOD 存在下,O-2 受到SOD 的催化形成H2O2 和O2 , 以被開發為SOD 的間接定量分析法 。 [2] 
但是, 活性氧的細胞色素丙還原法存在著其它還原性物質, 如HADPA 和還原性酶的干擾, 一般情況下無法直接用于O-2 的定性分析, 需要比較在SOD 的存在下, 是否還有O-2 與細胞色素丙發生反應的結果, 從而判斷O-2 的生成與否。
熒光光度法
與化學發光一樣, 熒光分光光光度法也是靈敏度高, 操作簡便的分析方法之一。比較典型的例子是, 二氯熒光素(DCFH)在過氧化物酶存在下, 被H2O2 或者HO-2 氧化形成具有有螢光的DCF , 可以有效地應用于H2O2 定量分析[ 23] 。利用2 , 3-二氨基萘(DAN)與NO-2 在酸性條件下發生反應, 形成熒光性的1-(H)-萘三氮茂環, 有人提出用2 , 3-二氨基萘(DAN)作為NO 的測定方法。 [2] 
電子自旋共振法
電子自旋共振法（ESR法） 作為活性氧的化學反應后的檢測方法, 可以理解成是一種自由基的標識反應, 即向活性氧生成的反應體系中添加本身帶有不對稱電子的自由基, 這一添加物與活性氧發生反應后失去不對稱電子, 從而導致ESR 信號的變化。