Protein A的詳細介紹

    Protein A是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質，能夠特異性地結合多種免疫球蛋白的Fc區段，與瓊脂糖凝膠以一定的方式結合，可用于抗體純化的親和填料。本產品純化過程條件溫和，對蛋白的活性影響小，可從腹水，血清，細胞培養上清或細胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物不同類及亞類的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白。Protein A經過基因改造，除去了一些不重要的非結合域（如白蛋白特異性結合位點），能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區結合，而不影響Fab片段和抗原的結合，大大提高了抗體的純度 。

使用步驟： 

（1）緩沖液的準備： 

結合緩沖液：大部分種類的IgG同蛋白A在中性條件下結合

洗脫緩沖液： 0.1M 甘氨酸緩沖液 pH 3.0，或0.1M檸檬酸鈉緩沖液pH 3.0

再生緩沖液：同洗脫緩沖液

中和緩沖液：1M Tris-HCl，pH 9.0

對于某些吸附載量較少的抗體，可適當向結合緩沖液多添加NaCl（可達3M）和/或提高pH值（可達8.2），以提高介質對抗體的吸附力。但是有時高pH會使雜蛋白吸附增加，使用者應根據實際使用狀況適當調節。不同的免疫球蛋白對蛋白A的吸附能力是不同的，即使是同一種屬、同一亞類的不同免疫球蛋白也有所差別，洗脫吸附較強的IgG時，洗脫液的pH值可能要降低到3.0以下。

以上緩沖液使用前均需0.45μm濾膜過濾。

（2）樣品的準備

樣品經硫酸銨粗提后，用結合緩沖液稀釋5~10倍，以保證樣品液的成分及pH和結合緩沖液接近。若上樣體積過大，可以采取調節樣品pH和鹽濃度的方式，使樣品中的緩沖體系與結合緩沖液相同。細胞培養液中大量的血清蛋白會對親和層析造成一定的干擾，去血清處理或稀釋樣品將提高純化抗體收率。

樣品在上柱前需0.45μm微孔濾膜過濾。

（3）操作步驟

a） 平衡：填料裝柱后，用結合緩沖液洗5-10個柱床體積洗掉乙醇并平衡柱子。

b） 上樣：將樣品上柱，上樣流速≤60cm/h。

c） 清洗：平衡緩沖液洗5~10個柱床體積，直至UV洗至基線。

d） 洗脫：洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，洗脫液立即用中和緩沖液中和到中性,濃縮到所需體積，加入50%甘油；測定效價后，分裝并保存在-20℃，避免凍結。

e） 再生：再生緩沖液流洗2~3個柱床體積。

f） 保存：先后用結合緩沖液、20%乙醇分別流洗3~5個柱床體積。兩端封閉，置于+4~8℃保存。