對藥品中雜質的控制是保證藥品用藥安全的重要環節. 伴隨著對藥品雜質特性的深入了解, 依據雜質的生理活性逐一制定每一個雜質限度的“雜質譜控制"理念已經被國內外普遍接受. 與“雜質譜控制"相關的關鍵技術問題可概括為: 復雜體系樣本的分離分析、微量組分的結構分析和微量組分的毒性評價三方面 .安徽省藥物結構確認及雜質分析-CMA資質

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安徽省藥物結構確認及雜質分析-CMA資質

品中雜質的控制是保證藥品用藥安全的重要環節. 伴隨著對藥品雜質特性的深入了解, 依據雜質的生理活性逐一制定每一個雜質限度的“雜質譜控制”理念已經被國內外普遍接受. 與“雜質譜控制”相關的關鍵技術問題可概括為: 復雜體系樣本的分離分析、微量組分的結構分析和微量組分的毒性評價三方面. 本文從雜質控制理念和雜質分析技術兩方面, 綜述了化學藥品雜質控制的現狀, 并就今后的發展提出自己的觀點.

3.1.2 藥品有關物質分析的現狀

按雜質譜控制的理念, 在藥品質量標準中, 要求所采用的分析方法不僅能分離出樣品中實際存在的雜質, 且能分離出各類潛在的雜質, 并對分離出的主要雜質能進行定性, 以便根據其來源和生理活性制定不同的質控限度. 縱觀各國藥典的發展, 利用反相HPLC 系統分析有關物質已成為藥品質量控制的主流. 通過與BP、EP 和USP 方法的比較, 確定HPLC 方法[24~28]是目前國內進行雜質分析方法修訂

的主要內容. 通過努力, 在ChP(2010)中幾乎所有的抗生素品種(包括原料和制劑)均采用HPLC 方法, 多數采用梯度洗脫實現對有關物質的控制; 且對β-內酰胺抗生素、喹諾酮抗生素、大環內酯類和氨基糖苷類抗生素等已經報道的各類雜質, 采用雜質對照品、混合雜質對照品, 結合相對保留時間、LC-MS 等方法,在HPLC 色譜圖中進行歸屬, 并制定相應的質控限度,其中數十種雜質已經通過雜質對照品等方法實現了單獨控制. 對大環內酯類和氨基糖苷類多組分抗生素, 如*中的*A、*B與*C; 他霉素中的組分A9、A8、A7、A6、A5、A4、A1、A3 和A13; *中的*A1、他霉素A6 及其他他霉素A 系列組分(A1、A2、A4、A6、

A8); 乙酰*的四個主要活性組分; 硫酸*中的四個C 組分含量及其中的*、西索米星和其他的未知組分等, 也已經通過HPLC 方法分別對其主組分、無效、未知組分分別實現了控制. 上述工作使得我國對化學藥品中雜質的控制水平與國外接近.對微量毒性雜質的控制是國內雜質控制的熱點.例如對引發β-內酰胺抗生素過敏反應的聚合物類雜質的控制. 1994 年Hu CQ 等[29]利用Sephadex G10 凝膠*對多種β-內酰胺抗生素中的高分子雜質進行了分析. ChP(2005)采用該方法*對多個*、*中的高分子雜質進行了控制. 但在以后的實踐中, Sephadex G-10 凝膠色譜柱效低、分離效果差等缺點逐步暴露[30]. 利用高效凝膠色譜法可以克服Sephadex G-10 凝膠色譜系統的部分不足. Cai SY等[31]利用Superdex Piptide 凝膠實現了對*中聚合物的分析; 顧立素等[32]利用TSK2500 PWXL 凝膠實現了對*鈉/*片中*聚合物的分析; 此外, 利用柱切換技術, 在反相HPLC系統中定位聚合物雜質, 可以實現聚合物雜質分析和其他有關物質分析的統一[33]. 在ChP(2010)中, 雖然仍有多個β- 內酰胺抗生素采用葡聚糖凝膠Sephadex G10 色譜系統控制其聚合物含量, 但高效凝膠TSK2000 色譜系統已經用于對*鈉聚合物的控制; 且通過對*鈉、*鈉、*鈉/*、*鈉/*及其制劑中二聚體的控制, 實現了利用“指針性雜質”對β-內酰胺抗生素聚合物類雜質進行控制的目的, 解決了凝膠色譜法測定聚合物易受干擾的問題. 這也將主導今后對β-內酰胺抗生素聚合物的分析. 此外, 粉針劑膠塞中釋放出的抗氧劑2,6-叔丁基-4-基-*(BHT)可以與*鈉等*發生締合反應并導致藥品的溶液澄清度下降[34], 豚鼠被動皮膚過敏試驗(PCA)顯示,*鈉溶液的混濁程度與其引發過敏反應的強弱密切相關(未發表資料), 因此關注注射用*粉針劑與膠塞相容性研究中的雜質變化及與藥品安全性的相關性是目前國內雜質研究的另一熱點.如何保證雜質分析方法的有效性是雜質譜分析的另一關鍵. 對沒有特征紫外吸收的化學藥如氨基糖苷類抗生素, 雖然國外更傾向采用電化學檢測器分析雜質, 但國內大量的研究報道表明, 采用HPLC-ELSD 檢測亦能滿足質控要求[35~40]. 在ChP(2010)中采用HPLC-ELSD 控制氨基糖苷類抗生素的雜質已經成為主流. 近年來, 作為HPLC 分析方法的有效補充, 采用高效毛細管電泳(HPCE)法[41, 42]和高效薄層色譜(HPTLC)法[43]分析藥物中雜質的報道日益增多[44, 45]. HPCE 不僅在對手性雜質的分析方面[46, 47], 且在對藥物中其他雜質的分析方面[48, 49]已突顯優勢. 膠束毛細管電泳法可有效分離藥物的各類同分異構體, 如*的R、S 異構體、順反異構體和Δ異構體, 且較區帶電泳具有更強的雜質分離能力(未發表資料). 在保持HPCE 分析重現性方面也已取得較大進展[50]. 但由于HPCE 的檢測靈敏度較低, 因此更適合作為反相HPLC 方法的互補驗證方法. 如能采用二維色譜相關光譜技術[51]實現HPLC 與HPCE 色譜系統中色譜峰的相互識別, 將真正實現利用不同原理的分離方法分析藥物中雜質的目標.

3.2 微量組分的結構分析

按ICH 要求, 對原料藥中含量大于0.1%的雜質需要進行結構鑒定. 能否快速的鑒別出藥品中雜質

的結構, 關系到 “雜質譜控制”理念應用的成敗. 雖然采用傳統的分離制備技術分離雜質, 再利用各種波譜學方法解析雜質的結構, 仍然是鑒別藥物中雜質, 特別是結構相對復雜的藥品的有效方法, 如抗癌新藥XP315[52]、*(linezolid)[53]、*[54]等, 但其效率極低, 這種研究模式對于分析“量少且不穩定的雜質”存在缺陷和困難. 而采用高分辨質譜推測可能結構, 再結合必要的波譜學分析, 是目前雜質結構分析的常用策略, 如對西酞普蘭(citalopram)[55]、依普羅沙坦(eprosartan)[56]、沙曲硝唑(satranidazole)[57]、*(rizatriptan)[58]等藥品中雜質的分析; 通過分析工藝中可能產生的雜質, 再通過反合成技術合成各種雜質, 也是可行的方案, 如對*(indomethacin)[59]、*(valsartan)[60]等藥品中雜質的分析.近年來, 中檢所致力于發展一套“分析雜質來源,推測雜質結構, 采用LC/MS 等技術驗證推測結構”的雜質快速鑒別方案, 希望根據雜質的來源, 產生條件,結合藥物母核的質譜裂解規律和雜質的產生原理推斷雜質結構, 并取得了一定的成功.在鑒定未知同系物結構方面, 利用紫外光譜圖獲取母核結構的信息; 通過一級質譜獲取分子量信息,二級質譜獲取碎片峰信息, 進而推測有關各取代基的情況; 再根據色譜保留行為來驗證所推測結果的正確性. 采用此策略, 結合對十六元環大環內酯類抗生素MS 裂解規律的探討[61], 已經成功鑒別出他霉素(kitasamycin)[62]、乙酰他霉素(acetylkitasamycin)[63]、*(meleumycin)[64]及國產一類新藥可利霉素(kelimycin)[65] (利用基因工程技術將碳霉素4″-異戊酰轉移酶(4"-O-acyltransferase)基因克隆到*產生菌中, 在微生物體向?；?(spiramycin, SPM) 得到的以4″- 異戊酰*(4"-isovalerylspiramycin, ISV-SPM)為主組分的十六元環多組分大環內酯類抗生素)中的諸組分結構. 利用氨基糖苷類抗生素的MS 裂解規律[66], 對*[36]、阿司米星[37]、*[38]、西索米星[39]等多個氨基糖苷類抗生素中的雜質及國產一類新藥依替米星中的諸雜質進行了較好的歸屬(未發表資料).對于反應機理已知的降解雜質, 首先根據反應原理設計加速實驗, 再通過一級質譜獲取分子量信息, 二級質譜獲取碎片峰信息, 并利用UV 特征和色譜保留行為來驗證所推測的結果, 必要時可通過NMR 對雜質的結構進行確證. 我們已經對β-內酰胺類抗生素的MS裂解規律進行了系統的總結[67], 并利用此策略成功地對*[68]、*二鈉等*中的主要降解雜質進行了鑒別. 該策略在對法羅培南[69]、*[31]、*[70]、蒜氨酸[71]、*[72]等主要降解雜質的結構鑒定中也得以驗證.對于MS 裂解規律尚不十分明確的藥物, 則主要依據其合成工藝, 推測合成中可能出現的各類副產物, 并通過反合成的方法合成這些雜質, 再利用LC/MS 的質譜和色譜保留值信息確定產品中是否含有該雜質. 采用此策略, 我們已成功地對*和多種喹諾酮藥物包括國產一類新藥安妥沙星中的雜質進行了歸屬.結合國家重大新藥創制項目中“創新藥物研究開發技術平臺建設”等國家項目的實施, 中檢所正在匯同有關單位進一步豐富各類藥物的MS 裂解數據庫,并在此基礎上研究同系物藥品雜質的裂解規律, 進而形成更完善的雜質鑒別策略.

3.3 微量組分的活性評價

在實現“雜質譜控制”的三個必需關鍵技術中,對微量雜質組分的毒性評價是薄弱的環節. 按ICH的規定[1], 當化學原料藥中的雜質含量大于0.15%時,應當對其限度的合理性進行評估(qualification). 當缺乏足夠的生物學實驗數據時, 定量結構性質/活性相關(QSPR/QSAR)分析方法可以用來初步評價、預測化合物的危險性. 國內的結構-毒性的關系研究主要集中在對環境污染物的研究. 如應用電拓撲狀態指數(electrotopological state indices, E-state indices)預測有機污染物的理化性質和毒理學性質[73]; 采用原子類型電拓撲指數(ETSIAT)為結構描述子, 研究脂肪醇毒性的定量構效關系(QSAR)[74]; 應用理論線性溶劑化能關系(TLSER)模型探討35 種有機磷酸酯類(OP)化合物的結構及其對家蠅急性毒性的關系[75], 應用基因表達式編程探討88 種醛類化合物分子結構與大鼠急性毒性的定量構效關系[76]; 周魯等對*類抗生素[77]、喹諾酮類藥物[78]的定量構動關系(QSPR)進行了探討; 這些研究方法對探討微量雜質組分的毒性評價具有重要的借鑒作用. 甘慧等綜述了幾類代表性化合物結構產生反應性代謝產物的情況,包括苯醌亞胺、噻吩環、氮翁離子、環氧化物、硫脲等, 試圖從代謝角度揭示藥物分子結構與藥物毒性之間的關系[79]; 林葉新等對苯甲酸等14 種食品防腐劑及叔丁基對苯二酚等6 種食品抗氧化劑的大鼠急性經口毒性[Log(LD50)]與其化學結構的關系進行了探討[80];提示對藥品中雜質組分的毒性評價已經引起關注.但如何將對雜質組分的毒性評價與雜質的質控限度

相關聯-危險度評估的研究尚較少見. 毒理學關注閾值(threshold of toxicological concern, TTC)原則作為一項新的危險度評價原則, 已相繼被多個組織認可和采納,并成功應用于評價食物中低水平暴露的化學物質和調味料等物質的毒理學安全性[81]. 應用TTC 決策樹評估藥物雜質組分的危險度, 有望幫助制定出更合理的雜質質控限度.近年來, 斑馬魚作為一種新的優秀模式動物已受到愈來愈多的關注, 已被廣泛地用于胚胎發育學、基礎醫學和藥學領域的研究. 利用斑馬魚進行藥物毒理學評價具有*的*性[82~84]; 不僅可以進行藥物急性毒性、亞急性毒性、慢性毒性的研究, 還可以評估藥品的靶器官毒性及毒性機制[85, 86]. 目前, 中檢所正在與中國醫學*醫藥生物技術研究所合作, 利用斑馬魚的胚胎毒性模型, 通過與藥物活性成分毒性的比較, 評價藥物雜質組分的危害性, 并已取得進展.

4 需要進一步關注的問題

實施雜質譜控制的基本策略匯總于圖3. 在藥品國家標準中按“雜質譜控制”的理念對藥品中的雜質進行控制是雜質控制的終目標, 而對雜質結構的推斷則是雜質研究/控制過程中的核心環節. 每年上發表有大量的與藥品雜質相關的文獻, 但由于文獻中采用的雜質分析系統通常與藥品標準中的色譜系統不同, 且一般無法得到相應的雜質對照品,故無法直接利用文獻結果歸屬藥品標準方法中分析到的雜質結構. 我們正在利用化學計量學方法, 希望

圖3 實施雜質譜控制的基本策略

借助于雜質的UV 光譜及MS 裂解譜, 利用色譜相關光譜/質譜裂解譜技術, 解決不同色譜系統中雜質的相互識別/追蹤問題[51, 87, 88]; 并正在進行雜質對照品的數字化研究, 將雜質對照品的定性信息(色譜保留值參數、UV、MS 和NMR 參數)和定量信息(雜質校正因子(normalization factor))形成數據庫, 逐步建立起國家藥品標準數字化雜質對照品庫, 這將加速在國家藥品標準中實施“雜質譜控制”的步伐, 提高國內新藥研發、仿制的水平.

涉及地區：廣東省藥物結構確認及雜質分析、浙江省藥物結構確認及雜質分析、福建省藥物結構確認及雜質分析、海南省藥物結構確認及雜質分析、云南省藥物結構確認及雜質分析、廣西藥物結構確認及雜質分析、貴州省藥物結構確認及雜質分析、新疆省藥物結構確認及雜質分析、四川省藥物結構確認及雜質分析、重慶市藥物結構確認及雜質分析、西藏省藥物結構確認及雜質分析、湖南省藥物結構確認及雜質分析、江西省藥物結構確認及雜質分析、湖北省藥物結構確認及雜質分析、上海市藥物結構確認及雜質分析、北京市藥物結構確認及雜質分析、天津市藥物結構確認及雜質分析、安徽省藥物結構確認及雜質分析、江蘇省藥物結構確認及雜質分析、甘肅省藥物結構確認及雜質分析、寧夏省藥物結構確認及雜質分析、內蒙古省藥物結構確認及雜質分析、黑龍江省藥物結構確認及雜質分析、吉林省藥物結構確認及雜質分析、遼寧省藥物結構確認及雜質分析、山東省藥物結構確認及雜質分析、陜西省藥物結構確認及雜質分析、山西省藥物結構確認及雜質分析、河南省藥物結構確認及雜質分析、河北省藥物結構確認及雜質分析

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