廣東省藥物結構確認及雜質分析-CMA資質
蛋白質組學的研究對象是一個在時間和空間上動態變化的整體，具有的復雜性。隨著蛋白質組學研究的深入和發展，尤其是差異蛋白質組學研究的進展，大量功能蛋白質和潛在疾病蛋白質標志物被發現并被鑒定，如何進一步探測這些蛋白質的表達豐度，以闡明其功能和在疾病研究中的意義，已變得越來越重要。僅僅依賴蛋白質大規模分離、鑒定的技術路線(雙向凝膠電泳技術分離蛋白質，質譜技術鑒定蛋白質) 已經不能滿足這些研究的需求，迫切需要更高靈敏度和更高選擇性的研究方法。而質譜多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)技術作為一種高特異性、高靈敏度的質譜數據獲取方式，在進行蛋白質組學更具針對性的研究中發揮了重要作用[1]，逐步受到更多的研究者們關注。
1. MRM 技術的原理
M R M 技術是基于已知信息或假定信息設定質譜檢測規則，對符合規則的離子進行信號記錄，去
除大量不符合規則離子信號的干擾，從而得到質譜信息的一種數據獲取方式。具體地說，即是根據多肽母離子質量數和碎片離子質量數，選擇母離子- 子離子對，允許符合設定的母離子進入碰撞室，碰撞完成后，只記錄設定子離子信號。通過母離子和子離子的兩次選擇，去除干擾離子，降低化學背景，提高靈敏度[2]。在分析化學領域，這種質譜掃描模式已成熟地用于復雜體系中小分子化合物的分析，如環境分析、毒物分析、藥物代謝物分析等[3,4]。而近年來MRM 技術與多種質譜掃描模式的靈活結合，例如MIDAS(MRM-initiated detection and sequencing，是基于M R M 獲取的信號結果，對達到設定信號閾值的多肽再進行高分辨產物離子掃描，從而對目標肽段進行高靈敏度鑒定的方法)，使復雜目標物的定性結果更為可靠，拓寬了其在蛋白質組學領域的應用。
2. MRM 技術的特點
靈敏度高：MRM 技術通過兩級離子選擇，排除了大量干擾離子，使質譜的化學背景大大降低。目
標檢測物的信噪比顯著提高，能夠完成其他質譜掃描方式所*的高靈敏度檢測。重現性好：質譜信號重現性差在一定程度上是因為復雜生物樣本基體和共流出組分對待測分子離子化、質譜信號的抑制及源內碰撞碎裂過程的影響導致。而在M R M 技術質譜信號采集中，后兩者的影響被大大降低，因此重現性也相應提高。準確度高：利用M R M 技術特異性，對符合設定的多肽進行檢測，并且進一步進行增強產物掃描分析，得到高分辨的串聯質譜(MS/MS)碎片數據，使分析過程中的定性結果假陽性率大大降低。該技術與中性丟失相比，后者易檢測到一些產生相似質量丟失的假陽性肽，而一些不易產生中性丟失的目標肽也有可能沒被檢測。而M R M 技術則尋找產生特異碎片的特異母離子，鑒定準確度高于全掃描和中性丟失質譜掃描模式。通量高：使用目前進的質譜系統，MRM 技術每個工作循環能處理多達300 對母離子- 子離子，這種特點為研究多種蛋白質的多種修飾和豐度變化提供了機會，更能滿足蛋白質組學的研究需求。
3. MRM 技術在生物標志物檢測中的應用運用蛋白組學的方法進行生物標志物的發現和檢測是目前蛋白質組研究的熱點。隨著蛋白質組學技術的發展，采用二維凝膠電泳或鳥法(shotgun)技術尋找上調或下調蛋白質以發現生物標志物的研究策略已得到很大的豐富和完善。目前，標志物發現- 驗證- 臨床確證的研究模式已得到研究者們的廣泛認可[5,6]。即在發現階段從疾病組織中尋找與正常組織有差異的蛋白質，到驗證階段使用M R M 技術于組織周邊體液或血漿中檢測該差異蛋白質，利用子離子譜進行定性，后用M R M 技術和同位素稀釋或質量標簽標記(mTRAQ)的方法對篩選出來的標記物定量，進行臨床確證。這種研究模式使體液中生物標志物的發現和驗證更為有效、科學和合理。MRM 技術與金標準ELISA 相比，周期更短、成本更低，更重要的是能進行與同一疾病相關的多個標記物同時測定且不需制備其相應的抗體，具有*的應用*性。M R M 技術在驗證和確證階段都有極其重要的應用，充分體現了該技術在生物標志物檢測領域的價值。例如，在Whiteaker 等[7]的研究中，以小鼠為模型研究乳腺癌的生物標志物；用液相色譜串連質譜(LC-MS/MS)對腫瘤和正常乳房組織的蛋白質進行檢測，篩查出700 個以上差異蛋白質；再聯合抗體和MRM 技術后鑒定了fubulin-2 作為血漿中的生物標志物。實驗結果進一步驗證了M R M 技術驗證生物標志物的方法，在發現新型生物標志物研究中的可行性。Kuhn 等研究[8]表明，MRM 技術與同位素標記相結合進行定量分析，可以節省分析時間，并且能得到與抗體和免疫分析等經典驗證方法具良好相關性的檢測結果。他們采用同位素標記合成肽段和MRM 技術相結合，檢測來自類風濕性關節炎患者血漿樣本中診斷標記物C- 反應蛋白的濃度，并對方法的回收率、線性等進行了考察，結果能達到高達66%的回收率和3 個數量級以上的線性范圍。
4. MRM 技術在蛋白質翻譯后修飾研究中的應用蛋白質翻譯后修飾在許多生命活動的調節過程中起到非常重要的作用。蛋白質翻譯后修飾過程的闡明，有利于人們更深刻地理解生命體的生理和病理過程。以蛋白質磷酸化修飾為例，MRM 技術在翻譯后修飾的研究領域中顯示了其*的特點和優勢。例如，磷酸化蛋白質被酶切后，磷酸化多肽的信號淹沒在大量非磷酸化多肽的信號中，需要進行磷酸化多肽的富集來提高分析靈敏度，改善分析效果，但即便如此仍難以獲得滿意的分析結果，靈敏度低遺漏大量信息。而以下幾個實例則充分展現了MRM技術在蛋白質磷酸化分析中的優勢。
Unwin 等[9]采用MIDAS 模式在對蛋白質磷酸化修飾研究所得到的結果中，既使對于500 fmol 蛋白
質混合物中僅有20 fmol磷酸化蛋白質這樣信號被高度抑制的情況，也能夠得到磷酸化多肽的檢出，比用母離子檢測動態范圍提高了一個數量級。Wolf-Yalin等[10]在用IDA(information dependant
acquisition；選擇一級質譜信號中豐度的三個離子進行子離子掃描的一種質譜信號采集方式)-MRM方法定量分析蛋白質磷酸化介導的信號通路過程中，比較了I D A 信號采集模式和M R M 信號采集模式對酶切多肽混合物四次分析得到的肽段鑒定重復性實驗結果，前者的重復性僅為34%，而后者高達88%。重復性的提高體現了M R M 技術的優勢，更有利于對磷酸化修飾的動態變化進行監測和構建其相互作用網絡。Ahmed 等[11]同樣采用MRM 的方法，對細胞內外生物標志物的多種修飾進行研究，定量了16 個生物標志物，并對這些細胞內外蛋白質修飾的功能作了初步闡釋。
5. MRM 技術在定量蛋白質組學研究中的應用復雜組分共流出物的干擾和寬達9 個數量級以上的動態范圍，一直是影響血清或血漿等生物體液中蛋白質、多肽準確定量的關鍵因素。盡管研究者們也嘗試采用多種方法，包括盡可能充分的色譜分離，去除高豐度蛋白質等，但質譜對低豐度蛋白質
的檢測靈敏度和精密度仍不能滿足分析的要求。M R M 技術在定量蛋白質組學應用上展現了其方法
的優點。首先，在一定程度上提高了測定的動態范圍，其原因一方面是因為對離子的選擇檢出，降低了復雜組分的背景信號，增強了一些低豐度蛋白質的檢測靈敏度；另一方面通過對高豐度、低豐度蛋白質M R M 離子對的選擇來均衡兩者的響應信號差異。例如，對高豐度蛋白質，選擇響應豐度較低的母離子- 子離子對；對低豐度蛋白質，選擇響應程度較高的母離子- 子離子對，從而均衡高、低豐度的信號差異。其次，減少了復雜組分共流出物的干擾，增強了檢測的特異性。此外，MRM 技術高通量的特點，也為多種蛋白質的同時定量提供了條件。M R M 技術通過與同位素稀釋法或m T R A Q 技術結合，對已知量加入的內標肽段和樣本中的真實肽段分別進行標記，選擇不同母- 子離子對獲得不同的色譜檢出信號，比較兩者信號，從而產生定量結果[12,13]。
Anderson 等[14]用MRM 技術定量分析了人體血漿中53 種高、中豐度蛋白質。其中47 個數據同批變異系數為2%～22%，顯示了定量的良好精密度。分析結果的動態范圍達到4.5 個數量級。Lin 等[15]用M R M 定量測定了人體血漿中中等豐度蛋白質的實際濃度。測定結果表明其濃度范圍達到了3～700 nmol/L。12 次反復測量變異系數(CV)值小于25%。對于血漿中的低豐度蛋白質，Keshishian 等[16]也采用MRM 和同位素稀釋的方法進行了定量分析。在未進行蛋白質或多肽親和富集的條件下，去除血漿6 種高豐度蛋白質后，低豐度蛋白質的檢測限在1～10 mg/L，CV值在3%～15%，與質譜直接檢測血漿蛋白的方法相比，分析性能改善了1000 倍。實驗結果顯示了這種MRM 技術進行定量的高精密度，以及用于分析復雜樣本的高動態范圍。
6. MRM 技術在蛋白質與RNA 相互作用研究中的應用蛋白質- R N A 復合物在調控真核細胞的基因表達上具有重要意義?；贛 S 的方法研究蛋白質與R N A 的相互作用多有報道，而采用M R M 與其他技術相結合的方法，能更深入地研究蛋白質與RNA 作用的結構域，得到更豐富的相互作用結構信息。其原理是：通過母離子掃描的模式，獲得含有磷酸碎片的所有多肽離子的準確分子量和電荷數。設計MRM 離子對，母離子掃描獲得的信號離子作為母離子，子離子設定為堿基序列AUGC ，在MRM 的檢測域值達到設定值后，進行高分辨增強子離子掃描, 終獲取蛋白質序列信息和與其作用的R N A 序列信息。Lenz 等[17]采用此方法，研究了U1SnRNP 和1515K-61K-U4atacSnRN 與RNA 的相互作用信息，分別用*和R N A 酶T 1、A 對蛋白質和R N A 進行酶切，得到相互作用的短肽段和RNA 的短序列，在負離子模式進行母離子掃描，依據獲得的結果設計MRM 母- 子離子對，在正離子模式進行MRM-子離子增強掃描，后得到了相互作用結構域等更為詳細的信息。
7. 展望M R M 技術是基于蛋白質或多肽的已知信息或假定信息進行質譜信號采集，有針對性地獲取數據的方式。通過與其他質譜掃描技術的聯合使用，能在蛋白質組研究中充分展現其高靈敏度、高準確性、高重復性、高通量的應用優點。可以預見，通過對M R M 技術的進一步優化，例如優化M R M 母－子離子的選擇條件，從已有的蛋白質譜中人工獲取或利用軟件計算母- 子離子；優化每次運行MRM 離子對的數目，改善色譜峰形，或者通過設立不同時間段檢測離子對，增加分析通量；聯合其他多種質譜掃描技術，將使M R M 技術擁有更好的應用前景，更有效地滿足蛋白質組學的分析需求。
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