環磷酸鳥苷（鳥苷-3´,5´-環化一磷酸，cGMP）在許多生理過程中發揮著重要的調控作用。cGMP由鳥苷酸環化酶產生，而被磷酸二酯酶降解，因此激活鳥苷酸環化酶或者抑制磷酸二酯酶可以提高細胞內cGMP的含量。研究發現，cGMP特異性磷酸二酯酶的抑制劑可用于治療人類疾病，如cGMP特異性磷酸二酯酶第5類型可用于治療勃起功能障礙等疾病。

詳細介紹

Monoclonal Anti-cGMP Antibody Based

Direct cGMP ELISA Kit
(New Non-acetylated Version)
Catalog No. 80103
96 Well Kit

產品描述

此為篩選出腺苷酸環化酶的激活劑或磷酸二酯酶的抑制劑，需要一個高敏感度、特異性的、可重復的方案用于檢測cGMP的含量?？紤]到大分子的化合物可能存在較弱的影響，這一個初篩是有必要的。

目前商業化提供的一些cGMP檢測試劑盒主要使用的是非親和純化的cGMP多克隆抗體。盡管據稱有特異性，但這些多克隆抗cGMP抗體與cAMP和GTP呈現一定程度的交叉反應。且在大多數細胞類型中，cGMP含量低于cAMP 100倍。

紐斯特生物的cGMP ELISA 檢測試劑盒使用的是鼠單克隆抗cGMP抗體，該單克隆抗cGMP抗體的特異性比cAMP、GTP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體cGMP試劑盒，紐斯特生物cGMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性，且能有效避免來自動物多克隆抗體的批次間差異，因此可以提供*有效地可重復性定量檢測。

此外，其他ELISA試劑盒的多克隆抗cGMP抗體與乙?；痗GMP的親和力明顯高于非乙?；痗GMP，而本試劑盒的單克隆cGMP抗體與乙?；蚍且阴；痗GMP具有同樣的親和力。因此，紐斯特生物cGMP ELISA試劑盒中的樣品和標準品不需要乙?；幚恚瑥亩黠@縮短了分析時間，有效避免了乙酰化過程中的有機試劑的使用，為大家提供了一個更安全、更健康的工作環境。

工作原理

本試劑盒利用競爭酶聯免疫分析方法來測定細胞提取物或體外鳥苷酸環化酶實驗中的cGMP的水平。簡而言之，將羊抗鼠抗體包被在酶標板上，細胞提取物或體外鳥苷酸環化酶實驗中的cGMP與固定數量的偶聯辣根過氧化物酶的cGMP競爭性的結合抗cGMP單克隆抗體，已知的cGMP作為標準品來做標準曲線。經過一段時間孵育，洗掉所有試劑，加入底物進行顯色。將多孔板置于酶標儀上，于450nm波長下，進行讀數。黃光強度與樣品中cGMP的濃度呈反比關系?；赾GMP標準品所得曲線，通過測得的光密度可以計算出樣品中cGMP的濃度。

研究背景

cGMP作為*的第二信使，可調節細胞對各種外源和內源信號分子的反應。 cGMP主要通過激活蛋白激酶、控制特定的離子通道、磷酸二酯酶調節細胞環核苷酸濃度來調節不同的生理過程（8），如血管平滑肌松弛、上皮細胞電解質運輸、骨生長、白細胞遷移、軸突引導、jing子運動、血小板蔓延以及血管通透性等（1-9）。

通過鳥苷酸環化酶可以實現GTP轉化為cGMP。在哺乳動物中，存在2種類型的鳥苷酸環化酶:可溶性及膜結合的鳥苷酸環化酶(8,10,11)?？扇苄原h化酶在一氧化氮與血紅素輔基結合后，即被激活。七層膜結合鳥苷酸環化酶（即跨膜鳥苷酸環化酶或鳥苷酸環化酶微粒）已被證實存在于人類基因組中，鳥苷酸環化酶A和B是利尿鈉肽受體，鳥苷酸環化酶C能被熱穩定細菌腸毒素、鳥苷素和脲激活?？缒B苷酸環化酶的活性亦受胞內信號通路的其他受體信號所調控。（12）

試劑盒組成材料

1. 羊抗小鼠IgG包被的96孔微孔板，1張， Catalog No. 30101

該微孔板是將特異性識別小鼠IgG 的山羊抗體包被于可拆分酶標條上

2. cGMP偶聯的辣根過氧化物酶， 6mL， Catalog No. 30102

本包裝含1000×偶聯酶儲存液和稀釋緩沖液。

注意：為了穩定和*的實驗，抗體儲存于-80℃。在使用前將6μL 1000×偶聯酶儲存液加入到6mL 稀釋緩沖液中配制為工作液，并輕輕混勻。
工作液請避免反復凍融。

3. cGMP的小鼠單克隆抗體， 6mL， Catalog No. 26001-2

本包裝含1000×抗體儲存液和稀釋緩沖液。

注意：為了穩定和*的實驗，抗體儲存于-80℃。在使用前將6μL 1000×抗體加入到6mL 稀釋緩沖液中配制為工作液，并輕輕混勻。工作液請避免反復凍融。

4. 中和液， 6mL， Catalog No. 30103

5. 10×濃縮洗滌液， 15mL， Catalog No. 30106

含去污劑的磷酸鹽緩沖液。

6. cGMP標準品， 0.25mL， Catalog No. 30114

cGMP濃度5000pmol/ mL

7. 顯色底物A，10 mL， Catalog No. 30107

8. 顯色底物B， 10mL， Catalog No. 30108

9. 終止液，6mL， Catalog No. 30110

注意：該溶液有腐蝕性；儲存時請旋緊瓶蓋

試劑盒儲存要求

本試劑盒所有組分在有效期限內，于4℃穩定保存。為了*的實驗，1000×儲液請保存于-80℃。

本試劑盒未提供的必需試劑

去離子水或蒸餾水。
濃鹽酸。

量程在5μL至1000μL之間的精密移液管。

量程為50μL和200μL的中繼移液器。

用于稀釋儲液的一次性燒杯。

刻度量筒。

微孔板振蕩器。

吸水紙。

酶標儀，可讀波長450nm，在570nm至590nm之間應有修正。

樣品處理

該ELISA試劑盒適用于檢測經過鹽酸處理而終止內源性磷酸二酯酶活性的cGMP樣品。這種樣品可直接應用于檢測，而不需要汽化和進一步的處理。

組織樣品

組織樣本需預先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細粉末。待液氮揮發完后，稱量冰凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心，取上層清夜用0.1M HCl稀釋至適當濃度。

細胞樣品對于生長的組織培養液中的細胞，首先移除培養基，然后加入0.1M HCl處理細胞。孵育10分鐘并觀察細胞是否被裂解；如果裂解不充分，接著孵育10分鐘并觀察。以大于600g離心力于室溫離心，收集上清直接用于實驗。臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強細胞和組織裂解。在這個濃度范圍內，去污劑并不干擾試驗的結合部位，但是會適度的增加光密度值。含有Triton的樣品需利用標準曲線估計濃度，為了精確的測定，標準曲線需以相同方式稀釋。取1 mL細胞培養上清加入10μL濃鹽酸，600g離心力于室溫離心，上清液直接用于實驗測定培養基中cGMP。

注意步驟

在使用前，將所有試劑放置30分鐘，平衡至室溫。

用試劑預先潤洗槍頭在使用；取各種樣品、標準品和試劑必需更換槍頭。

移取標準品和樣品到微孔底部。

從微孔的邊緣加入試劑，以避免污染。

該試劑盒使用可拆分的微孔酶標條，使用者可根據樣品量多少進行拆分。未使用的酶標條保持干燥，密封于試劑盒提供的鋁封袋中，于4℃保存。微孔酶標條需安裝在相應的框架上使用。

在加入顯色底物前，確保微孔內沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導致分析結果的變化。

試劑準備

非乙?；痗GMP標準品將5000 pmol/mL cGMP標準品溶液平衡至室溫。從#1至#7標記六只潔凈試管。移取475μL 0.1M HCl到#1號試管，400μL到#2至#7號試管。加入 25μL 5000 pmol/mL cGMP標準品到#1管中，劇烈渦旋震蕩。從#1管中取出100μL溶液至#2管中，渦旋震蕩。以此類推，重復上步操作，梯度稀釋至#7管。

經以上操作，#1至#6管中cGMP標準品濃度分別為250,50，10,2,0.4，0.08和0.016 pmol/mL（詳見cGMP加樣表）。稀釋過的標準品需在30分鐘內使用。

標記一只試管作為無標準品空白對照（NSB）。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。

洗滌液將15 mL 10×洗滌液儲液加到135 mL去離子水中，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限，或者3個月。

實驗步驟

使用前將各種試劑取出放置30分鐘，平衡至室溫。所有標準品和樣品必需設置平行對照實驗。
快速加入試劑至樣品中，立即漩渦震蕩2秒混勻。

依據加樣表決定酶標條的使用量，將剩余的酶標條連同干燥劑一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。

移取50μL中和液至各個微孔中，除了TA(總活性)孔和Blank(空白)孔。

移取100μL 0.1M HCl至NSB(非特異結合)孔和B0孔(0 pmol/mL cGMP標準品)。

移取100μL cGMP標準品至相應的孔。

移取100μL樣品至相應的孔。

移取50μL 0.1M HCl至NSB(非特異結合)孔。

移取50μL 偶聯酶至各孔中，除了TA(總活性)孔和Blank(空白)孔。

移取50μL 抗體工作液至個孔中，除了TA(總活性)孔、Blank(空白)孔和NSB(非特異結合)孔。

將酶標孔置于孔板振動器上，250~500rpm，室溫孵育2小時。

在吸水紙上拍干微孔內溶液，加洗滌液400μL每孔洗3次，每次需拍干。

*次洗滌，清空各微孔，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標板數次，以確保沒有洗滌液殘留。

加5μL 偶聯酶至TA(總活性)孔。

每孔200μL顯色底物溶液，于室溫靜置5~30分鐘。（顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內等體積混合，并避光放置。）

每孔加入50μL終止液。終止后立即讀數。

清除酶標儀Blank(空白)孔值，讀取405nm處的光密度值，在570nm至590nm之間*有修正。如果酶標儀不能自動清除Blank(空白)孔值，那么手動扣除每個讀數的Blank(空白)孔光密度值。

結果計算

樣品中cGMP濃度有多種計算方法。X軸表示cGMP標準品濃度，Y軸表示凈光密度的平均值或者百分比值。

樣品和標準品的凈光密度(OD)平均值的計算：

凈OD平均值 = OD平均值－ NSB孔OD平均值

計算不同梯度濃度標準品的結合率占*結合率(B0孔)的百分比，計算公式如下：

百分比值 = (凈OD平均值/ B0孔OD平均值)×100

繪制凈OD平均值或百分比值對cGMP標準品濃度的Logit-Log曲線。通過插值即可得到樣品中cGMP濃度。

標準曲線

下面的曲線不能用于計算cGMP濃度。每次實驗需新做一條標準曲線。

靈敏度

通過比較10個B0孔平均光密度值(OD)和10個#6管標準品的平均光密度值，計算出靈敏度。cGMP濃度的檢測極限通過標準曲線上0位置的兩個標準偏差來測定。

線性關系

cGMP濃度為16.0pmol/mL的樣品，用0.1M HCl進行連續七次1:2梯度稀釋。將實際的cGMP濃度和測定的cGMP濃度繪制圖表。該直線的斜率為1.000，相關系數為0.999。

交叉反應

部分相關化合物的交叉反應由競爭ELISA測定。將可能的交叉反應物溶解到試劑盒分析緩沖液中，濃度從500 pmol/mL至500,000 pmol/mL。將這些樣品用該試劑盒測定，實測cGMP濃度以50%B/Bo進行計算。交叉反應的%通過比較檢測到的交叉反應物濃度和實際的反應物濃度得到，并以百分比的形式表示。

關鍵詞：酶標儀移液器振蕩器