百螢小課堂之-鈣黃綠素系列產品相關問答

鈣黃綠素是一種鈣依賴型熒光分子。它主要用于研究體內條件下的骨代謝，并有助于在 體外條件下對凹陷區域進行染色。鈣黃綠素被用于鈣的熒光測定以及鈣的EDTA（乙二胺四乙酸）滴定。跟著百螢來一起探索鈣黃綠素的相關問題吧！

問：什么是鈣黃綠素？

答：鈣黃綠素通常用乙酰氧基甲基酯（例如鈣黃綠素 AM）進行修飾以促進膜通透性，并廣泛用作檢測活細胞的活力指示劑。 它與幾種藥物相關的測定有關，包括細胞毒性、氧化功能和神經毒性。

問：鈣黃綠素,AM如何工作？

答：鈣黃綠素 AM 是鈣黃綠素的乙酰甲氧基衍生物，是一種可透過膜的熒光酯酶底物，用于測定細胞活力和膜完整性。 鈣黃綠素 AM 的親脂性使其能夠自由擴散穿過細胞膜并滲透到活細胞的胞質溶膠中。 進入細胞后，非特異性細胞內酯酶會酶促去除 AM 基團，由此產生的去酯化鈣黃綠素產物會被困在細胞內。 在藍光激發下，鈣黃綠素在 521 nm 處發出明亮的綠色熒光。 鈣黃綠素的熒光強度與細胞酯酶的活性和樣品中存在的活細胞數量成正比。

問：鈣黃綠素,AM 有毒嗎？

答：鈣黃綠素AM的SDS表明它是一種無害物質或混合物。在生命科學和藥物發現研究中，鈣黃綠素AM由于其相對較低的細胞毒性，通常用于研究酶活性、細胞活力、膜完整性和長期細胞追蹤。然而，對于特定的細胞系和實驗條件，高濃度的鈣黃綠素AM已被證明對細胞具有毒性。

問：鈣黃綠素AM是熒光的嗎？

答：不，鈣黃綠素 AM 是一種非熒光酯酶底物。 然而，在活細胞中，鈣黃綠素 AM 可以被動地穿過細胞膜并進入胞質溶膠，從而使非特異性細胞內酯酶水解來自鈣黃綠素 AM 的乙酰氧基甲酯，從而產生高熒光鈣黃綠素產物。 鈣黃綠素分別在 501 nm 和 521 nm 處具有激發和發射峰，并在激發時產生強烈的綠色熒光。 測得的信號強度與起作用的細胞酯酶的活性和存在的活細胞數量成正比。

問：鈣黃綠素AM 可以在細胞中持續多久？

答：鈣黃綠素是一種疏水性化合物，可以在具有完整質膜的活細胞中保留數小時至數天，具體取決于細胞類型、細胞形態或實驗條件。 在 Miles 等人于 2016 年進行的基于細胞的測定中，載有鈣黃綠素 AM 的前列腺癌細胞在 0.5、2、6、12、24 和 36 小時標記處成像。 在 36 小時標記處，細胞仍然發出適度的熒光； 然而，背景熒光有所增加（見圖片）。 增加的原因之一是有機陰離子轉運蛋白 (OAT) 對鈣黃綠素的擠壓，OAT 在調節陰離子平衡方面起著關鍵作用。 Probenecid 是一種 OAT 抑制劑，可以添加到鈣黃綠素 AM 工作溶液中，以提高去酯化鈣黃綠素在細胞內的保留并減少干擾。

問：鈣黃綠素AM在染色后可以固定嗎？

答：不能，無論使用何種固定方法 - 醛或甲醇固定 - 用鈣黃綠素 AM 染色的細胞都會失去其染色效果。 此外，鈣黃綠素 AM 不能用于固定細胞，因為它們缺乏將鈣黃綠素 AM 轉化為鈣黃綠素所需的酯酶以及保留染料所需的膜完整性。 鈣黃綠素 AM 是一種熒光酯酶底物，只能用于活細胞以確定細胞活力。如需此類實驗，請千萬注意！

問：鈣黃綠素AM能染色細菌嗎？

答：鈣黃綠素 AM 染色不僅適用于真核生物樣品，還可用于確定細菌樣品中的細胞活力。 Calcein AM 適用于檢測許多活的革蘭氏陰性細菌菌株，可用于微生物學研究、環境監測、藥物無菌檢測以及食品和植物評估技術。 與真核細胞一樣，細菌在其細胞質中含有微生物酯酶，可以裂解鈣黃綠素 AM 的親脂性封閉基團并將其轉化為熒光鈣黃綠素。 可以使用熒光儀器測量信號，其強度與存在的活細菌數量成正比。

問：鈣黃綠素是細胞滲透的嗎？

答：不，鈣黃綠素不具有細胞滲透性。 鈣黃綠素含有四個羧酸鹽基團，使化合物整體帶負電荷，帶電分子不能通過簡單的擴散穿過細胞膜，因為電荷被磷脂雙層內部的疏水尾部排斥。 為了促進滲透性，鈣黃綠素標記有幾個乙酰氧基甲基酯基團，例如鈣黃綠素 AM，從而形成不帶電的疏水化合物。 這種疏水性的增加使鈣黃綠素 AM 能夠自由擴散穿過完整的質膜并滲透到活細胞的胞質溶膠中。

問：如何制作鈣黃綠素溶液？

答：鈣黃綠素及其衍生物鈣黃綠素 AM 通常以凍干固體形式提供，在裝入細胞之前必須重新懸浮在溶液（通常是 DMSO）中。 要制作鈣黃綠素或鈣黃綠素 AM 庫存溶液，請在高質量無水 DMSO 中重組染料，使濃度約為 1 mg/mL。 例如，將 50 µL DMSO 添加到 50 µg 鈣黃綠素 AM 中將產生 1 mg/mL 庫存溶液。

對于鈣黃綠素 AM，在加載到細胞中之前，需要將庫存溶液進一步稀釋到水性緩沖液（例如 HBSS）中。 作為水溶液，鈣黃綠素 AM 易水解，應在一天內使用。圖為儲備溶液的配制方案，供參考。

問：鈣黃綠素AM陽性對照和陰性對照是什么？

答：陽性對照：這是在正常培養環境中生長的健康、未經處理的細胞群。 未經處理的健康細胞既含有胞內酯酶將鈣黃綠素 AM 水解成熒光產物，又含有完整的質膜以保留染料。 用鈣黃綠素 AM 染色陽性對照會導致細胞在藍光下激發時發出綠色熒光。

陰性對照：這是一群死細胞，通常用乙醇或甲醛固定。 死細胞不含細胞內酯酶，因此不能將非熒光鈣黃綠素 AM 底物轉化為熒光鈣黃綠素產物。 用鈣黃綠素 AM 染色的陰性對照不會產生熒光信號。

在進行鈣黃綠素 AM 細胞活力檢測以對比結果的變化時，與目標樣本一起進行適當的陽性和陰性對照非常重要。 所有對照都應從與目標樣本相同的培養物中獲得。

問：AM（乙酰氧基甲基）基團對鈣黃綠素的作用是什么？

答：鈣黃綠素AM中的AM酯具有兩個關鍵功能。首先，AM酯與鈣黃綠素連接時，會將鈣黃綠素帶負電的羧基轉化為不帶電荷的疏水化合物。這通過使鈣黃綠素AM能夠自由地穿過質膜并滲透胞質溶膠來促進細胞滲透。其次，鈣黃綠素染料，雖然是AM酯形式，但是非熒光的。一旦細胞滲透到胞質溶膠中，非特異性細胞內酯酶切割出AM基團，熒光就會恢復。此外，AM酯的水解恢復了鈣黃綠素的負電荷，這時染料才可以被熒光儀器所檢測。

問：鈣黃綠素AM能染色死細胞或壞死的細胞嗎？

答：不，鈣黃綠素 AM 不會染色死細胞或壞死細胞，因為它們缺乏將非熒光鈣黃綠素 AM 轉化為熒光鈣黃綠素所必需的酶（例如，非特異性細胞內酯酶）。 由于未被細胞內酯酶切割的鈣黃綠素 AM 底物是非熒光的，因此成像前不需要洗滌步驟。圖示：在 Costar 黑色/透明底 96 孔板中用 Calcein UltraBlue AM（貨號 21908）染色的 HeLa 細胞的熒光圖像。 左圖：HH 緩沖液中的活 HeLa 細胞； 右圖：用冰冷甲醇固定的死細胞/壞死細胞。