Cy(Cyanine),也叫花青染料，是一系列在實驗中很常見的熒光化合物。跟著百螢一起看看它們是怎么工作的吧！
1.問：Cy3、Cy5、Cy7是什么？光譜特性如何？適用于哪些應用？
答：Cy3、Cy5和Cy7是一類熒光染料，常用于生物科學研究中的熒光標記和成像。它們屬于氰化染料家族，可以在特定波長下吸收光能，并在不同波長下發射特定顏色的熒光信號。
Cy3的最大吸收波長約為550納米，最大發射波長約為570納米；Cy5的最大吸收波長約為650納米，最大發射波長約為670納米；Cy7的最大吸收波長約為750納米，最大發射波長約為770納米。
Cy3、Cy5和Cy7廣泛應用于分子生物學和細胞生物學研究中的熒光標記。它們常用于熒光顯微鏡觀察、流式細胞術、免疫熒光染色、蛋白質和核酸定量等實驗中。
2.問：Cy3NHS酯在動物活體實驗中的注意事項有哪些？
答：(1)Cy3標記物在使用前需要稀釋到合適的濃度和pH值。一般推薦使用PBS或TBS緩沖液稀釋，避免使用含有氨基或巰基的緩沖液或添加劑，以防止與Cy3發生反應或還原。Cy3標記物的稀釋比例根據實驗目的和條件而定，一般在1:200-1:1000之間。
(2)Cy3標記物在使用過程中需要避免光照和高溫，以防止熒光淬滅或降解。Cy3標記物可以在4°C避光保存數月，或者在-20°C避光保存數年。如果需要凍存，可以加入適量的甘油或DMSO作為凍存保護劑。
(3)Cy3標記物在動物實驗中可以用于尾靜脈注射，進行活體成像。每次注射200μL(濃度0.5 mg/mL)，每5分鐘記錄一張動物在體內發射熒光的成像圖片，分析熒光藥物的分布情況。對照鼠不注射藥物，進行同時記錄。
3.問：磺化和非磺化的Cy3有什么區別？哪個更適合蛋白染色？
答：磺化的Cy3和非磺化的Cy3的主要區別是水溶性和標記方法?；腔腃y3在發色團上有兩個硫酸離子官能團，所以它的水溶性很高，可以直接在水溶液中進行標記反應，不需要有機溶劑助溶1。非磺化的Cy3的水溶性較低，需要預先溶解在有機溶劑(如DMF或DMSO)中，然后加入到生物分子的水溶液中反應。如果被標記的蛋白質對有機溶劑敏感，或者需要通過透析純化，那么磺化的Cy3是更好的選擇。另外，磺化的Cy3也有更好的光學穩定性和量子產率，發出的熒光更強更耐光照。兩種Cy3的熒光譜圖幾乎一樣，只是磺化的Cy3有微小的藍移。因此，在大多數情況下，兩種Cy3可以相互替換使用。百螢生物提供多種基團的Cy染料，歡迎選購
4.問：Cy3標記植物組織和動物組織，在實驗操作上有什么區別？
答：Cy3標記植物組織和動物組織在操作上的區別可能取決于不同的實驗目的和方法，但是一般來說，有以下幾點需要注意：
(1)植物組織通常有較厚的細胞壁，可能影響染料的滲透和結合。因此，在標記前可能需要用酶或機械方法處理植物組織，增加其滲透性；
(2)植物組織和動物組織的pH值可能不同，這可能影響染料的穩定性和熒光強度。因此，在選擇緩沖液時，需要考慮目標組織的pH值，并且避免使用含有氨基的緩沖液，如Tris或甘an酸，以免與染料競爭反應；
(3)Cy3染料有脂溶性和水溶性兩種類型，脂溶性染料需要加入有機溶劑助溶，而水溶性染料不需要，水溶性染料通常更穩定，更適合標記對有機溶劑敏感的生物分子；
(4)Cy3染料可以與生物分子上的氨基反應形成穩定的酰胺鍵，因此在標記時需要控制反應條件和比例，以達到理想的標記效率和熒光信號。一般來說，Cy3染料與目標分子的摩爾比在4-12之間為宜。
5.問：Cy5 馬來酰亞胺能否標記外泌體？如何操作？
答：Cyanine 5 maleimide是一種熒光染料，常用于對含有巰基的蛋白質或肽鏈進行標記。該產品可以標記外泌體，以下是一般的標記步驟：
(1)準備外泌體樣品：收集并純化外泌體樣品，確保樣品的純度和完整性。
(2)選擇適當的緩沖液：根據實驗需求選擇合適的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)。
(3)制備Cyanine 5 maleimide工作溶液：根據說明書，將Cyanine 5 maleimide溶解在適當的溶劑中，制備成工作濃度的溶液。
(4)反應標記：將外泌體樣品與Cyanine 5 馬來酰亞胺工作溶液混合，使其反應。反應時間和溫度可以根據實驗需求進行優化，一般在室溫或較低溫下進行。
(5)反應停止：添加還原劑(如二巰基乙醇)以停止反應，并消除未反應的Cyanine 5 馬來酰亞胺。
(6)清洗和去除未結合的染料：使用適當的洗滌緩沖液，如PBS，對標記后的外泌體樣品進行洗滌，以去除未結合的染料。
(7)分析和評估：使用熒光顯微鏡、流式細胞術或其他適當的技術，對標記后的外泌體樣品進行熒光檢測和分析。
參考文獻：Pishesha, N.; Harmand, T.; Smeding, L.; Ma, W.; Ludwig, L.; Janssen, R.; Islam, A.; Xie, Y.; Fang, T.; McCaul, N.; Pinney, W.; Sugito, H.; Ploegh, H. Single domain antibody-antigen adducts that target Class II MHC induce antigen-specific tolerance. Research Square, preprint. doi: 10.21203/rs.3.rs-192181/v1
6.問：Cy3酸和NHS酯有什么區別？適用性有什么不同？
答：Cy3 acid(貨號140)和NHS酯(貨號141)都是一種黃色熒光染料，用于標記生物分子中的氨基。它們的區別在于反應基團的不同。Cy3 acid是一種羧酸，可以與活化劑(如EDC)反應，形成活化羧酸，再與氨基反應。Cy3 NHS酯是一種N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS酯)，可以直接與氨基反應，形成穩定的酰胺鍵。
Cy3 acid和NHS酯的適用性也有不同。Cy3 acid可以用于標記含有羧基的分子，如核酸，通過轉化為NHS酯或其他活化形式。Cy3 NHS酯可以用于標記含有氨基的分子，如蛋白質，多
肽，或氨基修飾的核苷酸。Cy3 NHS酯比Cy3 acid更方便使用，因為不需要額外的活化步驟。
7.問：Cy3馬來酰亞胺常用于什么染色？它和Cy3NHS酯的區別是什么？
答：Cy3馬來酰亞胺(貨號142)常用于標記含有巰基的生物分子，比如半胱an酸和雙硫鍵等，然后用熒光顯微鏡或熒光酶標儀觀察或檢測它們的熒光信號。它和Cy3NHS酯(貨號141)的區別主要在于：
(1)Cy3馬來酰亞胺可以和巰基反應，而Cy3NHS酯可以和胺基反應。
(2)Cy3馬來酰亞胺的標記反應比Cy3NHS酯的標記反應更快、更高效、更特異。
(3) Cy3馬來酰亞胺的水溶性較低，需要使用有機共溶劑，而Cy3NHS酯的水溶性較高，不需要使用有機共溶劑。
8.問：Cy3NHS酯和Cy3雙NHS酯在蛋白染色方面有什么區別？
答：在染色方面的區別主要是：
Cyanine 3 雙NHS酯(貨號138)含有兩個NHS基團，可以與兩個氨基反應，形成雙綴合物。這種染料可能會在一些蛋白質上產生更高的熒光信號，但也可能會增加非特異性結合的風險。
Cyanine 3 NHS酯(貨號141)含有一個NHS基團，只能與一個氨基反應，形成單綴合物 。這種染料是一種常用的染料，可以與多種生物分子發生共價結合，但也可能會降低熒光信號的強度。
對于Cyanine 3 雙NHS酯，常用于標記含有多個氨基的生物分子，如多肽、蛋白質、寡核苷酸等，也可以用于高靈敏度的熒光檢測，因為Cyanine 3 雙NHS酯在與蛋白質結合后熒光大幅度增強。
Cy3 雙NHS酯注意事項：
(1)避免與含有羧基或硫醇基的生物分子反應，因為這些基團可能會與NHS基團競爭，導致非特異性結合或副反應。
(2)避免在強酸或強堿的條件下使用，因為這些條件可能會破壞染料的結構或熒光性能。
9.問：Cy3酰肼可以用于哪些應用領域？
答：Cyanine 3 酰肼(貨號146) 可以與含有醛基或酮基的分子反應，形成穩定的酰肼鍵。這種染料可以用于標記經過過氧化物酶氧化后的抗體和其他糖蛋白，或者標記受到氧化應激或脫氨作用的蛋白質，或者標記還原性的糖類。Cy3 NHS酯(貨號141)可以與含有氨基的分子反應，形成穩定的酰胺鍵。這種染料可以用于標記多肽、蛋白質和寡核苷酸中的氨基末端或伯胺。如果需要該類產品進行蛋白/抗體染色，請根據目標的反應基團和功能基團，按
需選擇。
10.問：Cy3NHS酯標記蛋白或抗體后，如何高效純化？
答：(1)(實驗常用)用凝膠過濾層析法：將標記反應液通過大小孔徑合適的凝膠過濾柱，用適當的緩沖液洗脫，收集流出液中的Cy3-蛋白標記物，并測定蛋白濃度和熒光強度。這種方法簡單快速，但可能會造成一些蛋白損失或稀釋。
(2)用逆相高效液相色譜法(RP-HPLC)：將標記反應液通過逆相C18柱，用不同比例的水和有機溶劑(如乙腈或甲醇)作為流動相進行梯度洗脫，收集適當的色帶峰，冷凍干燥后得到Cy3-蛋白標記物。這種方法可以有效地分離和純化Cy3-蛋白標記物，但需要專業的儀器和操作技術。
(3)用親和層析法：如果待標記的蛋白具有特定的親和性，可以利用親和層析法進行純化。例如，如果待標記的蛋白是抗體，可以用蛋白A或蛋白G柱進行純化；如果待標記的蛋白是GST融合蛋白，可以用gu胱甘肽柱進行純化。這種方法可以保留蛋白的活性和穩定性，但需要特定的親和配體和緩沖液。
11.問：Cy3鏈霉親和素和Cy3NHS酯在蛋白的標記方面有何區別？
答：Cy3鏈霉親和素(貨號16912)是一種將Cy3熒光染料與鏈霉親和素(streptavidin)結合的偶聯物，可以用于檢測生物su化的生物分子，例如抗體、配體或DNA探針。
它可以用于間接標記法，即先用生物su化的一級抗體或其他生物su化的探針與目標蛋白結合，然后用Cy3鏈霉親和素與生物su結合，產生熒光信號。
Cy3鏈霉親和素的操作方法取決于所使用的生物su化探針的類型和濃度，一般來說，需要先將樣品與生物su化探針孵育，然后用PBS或其他適當的緩沖液洗滌去除多余的探針，再加入適量的Cy3鏈霉親和素孵育，最后再次洗滌去除多余的偶聯物，就可以進行熒光檢測了。
12.問：Cy3疊氮化物和炔烴有什么關系？這兩個產品如何標記蛋白？
答：Cy3炔烴(貨號144)和疊氮化物(貨號143)可以在銅催化下發生[3+2]環加成反應，生成1,4-二取代的1,2,3-三唑衍生物，這種衍生物是Cy3染料的一種形式。
這種反應屬于點擊化學的范疇，因為它是高效、選擇性和正交的，即它不會受到其他官能團的干擾，也不會產生副產物。
Cy3炔烴和疊氮化物可以用來標記蛋白的方法是，將含有Cy3炔烴的蛋白和含有疊氮化物的標記分子(如抗體或其他配體)在銅催化下發生點擊化學反應，形成穩定的三唑連接，從而實現蛋白的熒光標記。
這種方法的優點是，它可以在溫和的條件下進行，不會破壞蛋白的結構和功能，而且反應選擇性高，不會受到其他官能團的干擾。 另外，Cy3染料是一種亮度高，熒光穩定，對pH不敏感的橘黃色熒光染料，它可以用532 nm激光線激發，并用TRITC濾光片組觀察。
13.問：Cy3 TCO是什么？它與Cy3 NHS相比有什么區別？
答：Cy3反式環辛烯 [Cy3 TCO](貨號900)是一種熒光染料，可以與四唑類化合物發生快速的點擊反應，形成穩定的共軛物。Cy3 TCO的優點是反應速度快，無毒，適用于多種生物體系。缺點是染料分子較大，可能影響標記分子的活性或穩定性。
Cy3反式環辛烯 [Cy3 TCO]和Cy3 NHS酯 [Cy3 NHS]是兩種不同的熒光染料，它們都可以用于標記含有氨基的生物分子，但是它們的反應機制和條件有所不同。Cy3 TCO是一種點擊化學試劑，它可以與四唑類化合物發生快速的無副產物的環加成反應。這種反應可以在水相或有機相中進行，不受pH、溫度、緩沖液等因素的影響。Cy3 NHS酯是一種活化酯試劑，它可以與氨基形成酰胺鍵3。這種反應需要在pH 7-9的緩沖液中進行，且受到水解、氨基競爭等因素的影響。因此，Cy3 TCO比Cy3 NHS酯具有更高的反應效率和選擇性，更適合標記活性或穩定性較低的生物分子。所以如果需要標記含氨基的生物分子，選擇不止Cy3NHS酯，Cy3 TCO也許是您實驗的更優良選擇，考慮自己的實驗條件，選擇最佳產品，可以事半功倍。
14問：Cy3四嗪是什么？它與其他常見的Cy3染料有何不同？
答：Cy3 tetrazine(貨號910)和其他Cy3染料的主要區別在于它們的反應基團和反應方式。Cy3 tetrazine是一種帶有四唑基團的熒光探針，它可以與TCO(反式-環辛烯)或其他應力烯烴發生特異性的點擊化學反應，形成穩定的生物結合物。這種反應具有快速、高效、無毒和無銅的優點。
15.問：PE-Cy5 Tandem和普通的Cy5染料相比，有什么優勢？
答：(1)PE-Cy5 Tandem(貨號2610)與FITC、PE在光譜上重疊范圍小，熒光干擾少，因此實驗中常將PE-Cy5 Tandem與FITC、PE搭配使用。普通的Cy5染料與單核細胞和粒細胞的非特異性結合多，實驗結果容易出現假陽性。
(2)PE-Cy5 Tandem具有較高的熒光強度和穩定性，可用于標記表達水平較低的蛋白。普通的Cy5染料的熒光強度和穩定性較低，適用于標記表達水平較高的蛋白。
(3)二者的染色步驟類似，主要根據蛋白的表達水平選擇適合自己實驗的產品。
16問：Cy5DIGE NHS酯是什么？它和Cy5NHS酯有什么區別？
答：Cy5DIGE NHS ester(貨號25306)是一種專門用于差異凝膠電泳(DIGE)分析的染料，它可以與C2DIGE和/或C3DIGE一起使用，來比較兩個或三個樣品中的蛋白質表達。Cy5DIGE NHS ester具有遷移匹配和高分辨率的蛋白質檢測能力。Cy5NHS則是一種更通用的染料，它可以用于標記核酸分子(DNA和RNA)以及其他生物分子。
