Amplite NADH檢測試劑盒（熒光法） 返回列表頁

Amplite NADH檢測試劑盒（熒光法）是美國AAT Bioquest 研發的檢測NADH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。

傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 傳統NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短UV波長使得這些方法具有低靈敏度和高干擾。 由于NAD和NADH的吸收較弱，紫外吸收方法需要較大的樣品量，如果樣品的可用性有限，則使相同的NAD和NADH測量不實用。

這種Amplite 熒光NADH檢測試劑盒為檢測NADH提供了一種便捷的方法。 系統中的酶在酶循環反應中特異性識別NADH。 此外，該測定具有非常低的背景，因為其在紅色可見范圍內運行，這顯著降低了生物樣品的干擾。 Amplite 熒光NADH分析試劑盒提供靈敏的一步法分析，可在100μL分析體積（1μM）內檢測少至100皮摩爾的NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行測定。 其信號可通過Ex / Em = 540/590 nm的熒光酶標儀或~576 nm的吸光度酶標儀輕松讀取。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優質的Amplite NADH檢測試劑盒（熒光法）。

實驗方案

96孔板測定示例

概述

準備NADH反應混合物（50μL）

加入NADH標準品或測試樣品（50μL）

在室溫下孵育15分鐘 -  2小時

監測Ex / Em = 540/590 nm處的熒光強度

1.準備NADH儲備溶液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADH儲備溶液。
注意：未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準備NADH反應混合物：
將10mL Amplite NADH測定緩沖液（組分B）加入NADH再循環酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。
注意：這種NADH反應混合物足以用于兩個96孔或四個384孔板。未使用的NADH反應混合物應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備NADH標準品的系列稀釋液（0至100μM）：
3.1將50μL的NADH儲備溶液（來自步驟1）加入到450μLPBS緩沖液（pH 7.4）中以產生100μM（100pmol / L）NADH標準溶液。
注意：稀釋的NADH標準溶液不穩定，應在4小時內使用。

3.2取200μL的100μMNADH標準溶液進行1：3連續稀釋，得到30,1,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADH標準品系列稀釋液。

3.3如表1和表2所述，將NADH標準品和含有NADH的測試樣品的系列稀釋液加入到固體黑色96孔微量培養板中
注意：根據需要準備細胞或組織樣本。

表1實心黑色96孔微孔板中NADH標準品和測試樣品的布局

注意：NS = NADH標準，BL =空白對照，TS =測試樣品

表2每個孔的試劑組成

*注意：將連續稀釋的NADH標準品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份

4.在上清液反應中運行NADH測定：
4.1將50μL的NADH反應混合物（來自步驟2）加入NADH標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟3.3），使總NADH測定體積為100μL/孔
注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應混合物。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時，避光。
4.3用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的熒光板讀數器監測熒光增加（在Ex / Em = 540 / 590nm處佳）。
注1：也可將板的內容物轉移到白色透明底板上，用吸光度酶標儀在576±5nm波長下讀數。 與熒光讀數相比，吸收檢測具有較低的靈敏度。
注2：對于基于細胞的NADH測量，建議使用ReadiUse 哺乳動物細胞裂解緩沖液* 5X *（cat＃20012）裂解細胞。