Tide Fluor 3亞磷酰胺 熒光探針 返回列表頁

Tide Fluor 3亞磷酰胺 熒光探針是美國AAT Bioquest生產的熒光探針，Tide Fluor 3（TF3）系列的光譜特性與Cy3的光譜特性基本相同。與Cy3探針相比，TF3家族具有更強的熒光和更高的光穩定性。此外，它們的熒光與pH不相關，pH值為3至11.這些特性使這種新染料系列成為Cy3的優良替代品。TF3標記的肽和核苷酸比用Cy3標記的肽具有更強的熒光和更高的光穩定性。在與我們的Tide Quencher 3（TQ3）配對時，可以開發出多種FRET肽和核苷酸來檢測蛋白酶和分子信標，從而提高了靈敏度和穩定性。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優質的Tide Fluor 3亞磷酰胺 熒光探針。

用Tide Fluor 染料標記氨基修飾的寡核苷酸

       以下方案已經過優化，可用于標記200μg（~6 A260 nm單位）的專有寡核苷酸。 您需要根據您的特定實驗調整操作方案。 您的氨基改性OLIGO必須進行處理以去除快速反應并消耗染料SUCCINIMIDYL酯的氨。

1.準備Oligo溶液（溶液A）

1.1將氨基修飾的oligo（~200μg）溶解在四硼酸鹽緩沖液（100μL，pH 8.5±0.5）中。

注1：寡核苷酸必須在5'末端用胺基合成。參見Appenxidx 1純化氨基修飾的寡核苷酸。

注2：避免使用含有伯胺的緩沖液，如Tris，因為它們與胺反應性化合物競爭結合。

2.準備染料溶液（溶液B）

2.1通過上下吸移將1mg染料SE溶解在100μLDMSO中（如果可能，> 10mg / mL）。將小瓶側面的溶液原液離心至小瓶底部。

注意：在開始綴合之前準備DMSO染料溶液。染料溶液的長期儲存可降低染料活性。任何含有染料的溶液都應避光。我們不建議您存儲DMSO染料溶液以備將來使用。

3.運行共軛反應

3.1在攪拌或搖動（保持反應混合物避光）的同時向染料溶液（B，20-50μL）中加入寡聚物溶液（A，100μL）。

3.2在室溫下在旋轉器或振蕩器上旋轉或搖動反應混合物4-6小時。

注意：在一個小時內每10分鐘輕輕渦旋一下小瓶，以確保反應溶液保持充分混合。不要劇烈混合，因為材料可能留在小瓶的兩側。六小時后，應標記50-90％的胺修飾的寡核苷酸分子。如果更方便的話，反應可以孵育過夜。然而，在大多數情況下，過夜孵育不會導致更高的標記效率。

4.純化染料 - 寡糖結合物

4.1通過乙醇沉淀標記的寡核苷酸進行初步純化

4.1.1將20μL（一般十分之一反應溶液體積）的3M NaCl和300μL冷無水乙醇（通常為兩個半反應溶液體積）加入反應小瓶中。

4.1.2充分混合溶液并將其置于-20℃下30分鐘。

4.1.3將該溶液在微量離心機中以10,000至15,000×g離心30分鐘。

注意：如果離心時間不夠長，可能會導致樣品丟失。

4.1.4小心取出上清液，用冷的70％乙醇沖洗沉淀1-3次并短暫干燥。

注意：一些未反應的標記試劑可能在反應過程中沉淀或可能粘在反應瓶的壁上。在離心之前，通過大量渦旋混合將該材料再溶解。重新溶解標記試劑可確保沉淀的寡核苷酸少被未反應的標記物污染。

4.2通過HPLC或凝膠電泳進行終純化

使用Tide Fluor 染料標記肽

       以下方案已經過優化，用于標記10 mg僅含有一個游離氨基的肽（MW~2000）。您需要根據您的實驗，調整實驗方案。

1.制備肽溶液（溶液A）

1.1將肽（~10 mg）溶解在DMF（~1 ml）中。

注1：肽必須用堿如三乙胺或碳酸鉀中和。

注2：避免使用含有伯胺的緩沖液，如Tris，因為它們與胺反應性化合物競爭結合。

2.準備染料溶液（溶液B）

2.1通過上下吸移將5mg染料SE溶解在500μLDMF中（如果可能，> 10mg / mL）。

注意：在開始綴合之前準備DMF染料溶液。染料溶液的長期儲存可降低染料活性。任何含有染料的溶液都應避光。我們不建議您存儲DMF染料溶液以備將來使用。

3.運行共軛反應

3.1向染料溶液（B，500μL）中加入肽溶液（A，1mL），攪拌或搖動（保持反應混合物不發光）。

3.2在室溫下攪拌反應混合物4-6小時。

4.純化染料 - 肽綴合物

4.1濃縮反應溶液并在C18柱上純化，得到所需的綴合物。通過HPLC分析級分，合并> 97％純度的級分并凍干。

注1：HPLC純化條件：TEAB緩沖液（三乙基碳酸氫銨，0.25mmol，pH = 7.0-8.0）用作緩沖液A，乙腈用作緩沖液B. HPLC在60分鐘內從0％B至30％B進行（流速：100毫升/分鐘）。

注2：操作過程中避免強光。