免疫組織化學技術常用試劑的配制

一、緩沖液

1. 0.01MPBS(PH7.2)液

NaCl 8g

Na2HPO4 1.15g

KH2PO4 0.2g (NaH2PO4)

加雙蒸水至 1000ml

2. 0.05MTBS(PH7.4)液

Tris(三羥甲基胺基甲烷) 12.1g

Nacl 17.5g

加雙蒸水至 1500ml

在攪拌下加濃HCL至PH7.4，再加雙蒸水至2000ml。

3. 0.02MTBS(PH8.2)液

Tris 4.84g

Nacl 17.5g

BSA 2.0g

NaN3 1.0g

加雙蒸水至 1500ml

在攪拌下加濃HCL至PH8.2，再加雙蒸水至2000ml。

(BSA—牛血清白蛋白;NaN3—疊氮鈉，為防腐劑)。

4. 0.05MTB液(PH7.6)

先配制0.05MTB液：

Tris 60.75g

1N HCL 約420ml

雙蒸水 至1000ml

配制方法：先以少量雙蒸水(300ml)溶解Tris，加入HCL后，再用1N HCL或1N NaOH將PH值調至7.6，再加雙蒸水至1000ml。

用時將0.5MTB稀釋10倍，即為0.05MTB液(PH7.6)液。

5. 0.05M醋酸緩沖液(PH3.5)

先配制0.1M的醋酸和醋酸鈉溶液

0.1M醋酸液：

冰醋酸 5.75ml

雙蒸水 加至1000ml

0.1M醋酸鈉液：

醋酸鈉 13.61g

雙蒸水 1000ml

再配制0.1M醋酸緩沖液：

混合即可

0.1M醋酸 210ml

0.1M醋酸鈉 790ml

用時將0.1M的醋酸緩沖液稀釋5倍，即為0.05M醋酸緩沖液(PH5.2)。

6. 枸櫞酸緩沖液

(1)PH3.5

枸櫞酸 2.55g

2.35g

雙蒸水 加至100ml

(2)PH6.0

21.01g枸櫞酸加入蒸餾水1000ml 0.1M枸櫞酸

29.41g加入蒸餾水1000ml 0.1M

使用時取0.1M枸櫞酸9ml和0.1M41ml，再加入蒸餾水450ml，即配成0.01M的枸櫞酸緩沖液(PH6.0±0.1)。用于微波修復抗原時。

二、顯色液

1. DAB (Diaminobenzidine) 顯色液

DAB(3.3—二氨基聯苯胺四鹽酸鹽) 50mg

0.05MTB(或0.01MPBS) 100ml

30%H2O2 30~40μl

配制方法：先以少量0.05MTB(或0.01MPBS)溶解DAB，充分溶解后加入剩余的TB或PBS，搖勻后(避光)過濾，顯色前加入30% H2O2，寧少勿多，便于掌握反應過程。陽性為棕黃色顆粒。

DAB有致癌作用，操作時應格外小心，避免直接與皮膚接觸，用后的器皿應充分沖洗，用后的DAB液不應沖入下水道，應集中深埋或清潔液處理后棄之。

2. AEC(3-amino-9-ethylcarbozloe)顯色液

AEC(3-氨基- 9-乙基卡巴唑) 20 mg

二甲酰胺(DMF) 2.5 ml

0.05M醋酸緩沖液(PH5.5) 50 ml

30% H2O2 25μl

配制方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前加入30% H2O2液。鏡下控制顯色時間。陽性為深紅色顆粒。

3. 4-氯-1萘酚(4-CL-1-NapHthol)顯色液

4-氯-1萘酚 100 mg

無水乙醇 10 ml

0.05MTB(PH7.6) 190ml

30% H2O2 10μl

配制方法：先將4-氯-1萘酚溶于無水乙醇中，然后再加入TB190ml，用前加入30%H2O2，顯色時間5~20分鐘。陽性結果為藍或深藍色。

4. α-萘酚顯色液(1)

α-萘酚AS-BI磷酸鹽 1mg

堅固紅TR鹽 2mg

底物緩沖液 2ml

二甲基甲酰胺(DMF) 40μl

配制方法：先將α-萘酚AS-BI磷酸鹽溶于40μl DMF中，再加入底物緩沖液2l，臨用*分鐘加堅固紅TR鹽。

底物緩沖液(PH8.2~8.3)

0.2M Tris 50ml

0.1M HCL 40ml

Mg2CL·6 H2O 20.3mg

左旋咪唑 20.4mg

雙蒸水 加至 100ml

結果為玫瑰紅色，若在底物顯色液中用堅固蘭BB鹽代替堅固紅TR鹽，終產物為深藍色。

5. α-萘酚顯色液(2)

α-萘酚AS-BI磷酸鹽 5mg

DMF 0.05ml

丙二醇緩沖液(0.05M，PH9.8) 5ml

堅牢藍 BB 2mg

配制方法：先將α-萘酚溶于DMF中，然后加入丙二醇緩沖液，臨用前加入堅牢藍BB，溶解過濾后使用。

丙二醇緩沖液(儲備液)

2mol/L：

2-氨基-2-甲基-1.3丙二醇 35.64g

6mol/L HCL 32ml

0.005M MgCL2 4ml

左旋咪唑 480mg

雙蒸水 加至 200ml

用HCL或NaOH調PH至9.8。

取上述儲備液1ml用雙蒸水稀釋至40ml備用。

陽性結果為藍色顆粒。

6. α-萘酚顯色液(3)

α-萘酚 15mg

DMF 0.5ml

堅固藍BB鹽 30mg

0.05M Tris-HCL(PH9.1) 50ml

左旋咪唑 12mg

配制方法：先將α-萘酚溶于DMF中，加入堅固藍，再加入Tris-HCL緩沖液，zui后加入左旋咪唑，*溶解過濾后立即使用。顯色為37oC，15~30分鐘，用0.1%中性紅復染30秒~1分鐘自來水沖洗，丙酮分化5秒鐘，流水沖洗。

陽性結果為藍色，細胞核為紅色或紫色。

銀顯色液

⑴ 顯色液

①2%明膠(或25%阿拉伯膠水溶液) 60ml

②枸櫞酸緩沖液(PH3.5) 10ml

③對苯二酚 1.7g加雙蒸水至10ml

④ 50mg加雙蒸水至2ml

①～③液用前依次混合，zui后加入④液，注意避光。

⑵ 乳酸銀顯色液

①20%阿拉伯膠 60ml

②枸櫞酸緩沖液(PH3.5) 10ml

③對苯二酚 0.85g/15ml

④乳酸銀 110mg/15ml

以上①～③液用前依次混合，zui后加入④液，注意避光。

上述兩種顯色液的25%阿拉伯膠可用雙蒸水代替，但此時反應明顯加快，要在鏡下密切觀察。

⑶ 醋酸銀顯色液

① 100mg/50ml雙蒸水

②10%明膠 10ml

③枸櫞酸緩沖液(PH3.5) 1.7g加雙蒸水至10ml

④對苯二酚 600mg

配制方法：將對苯二酚溶于③液，然后將②③液混合過濾，再加入①液。

三、酶消化液

1. 0.1%

100mg

0.1%氯化鈣(PH7.8) 100ml

配制方法：先配制0.1%氯化鈣，用0.1M的NaOH將其PH值調至7.8，然后加入充分溶解。用前將消化液在水溶中預熱至37oC，消化時間10~30分鐘。

2. 0.4%

400mg

0.1N HCL 100ml

配制方法：先配制0.1N HCL，然后將充分溶解，預熱至37oC后使用，消化時間30分鐘左右。

四、粘合劑

1. 鉻礬明膠液

鉻礬(或甲鉻礬) 0.5g

明礬(Gelatine) 5g

蒸餾水 1000ml

配制方法：先將少許蒸餾水溶解鉻礬(硫酸鉻鉀)后，再加入明膠及蒸餾水，于70oC水溶液中膠溶化后置電動磁力攪拌器上，持續攪拌均勻，如有沉渣可過濾后使用。

將清潔的載玻片置上述液體中浸泡數分鐘后，烤干備用，可防止脫片。

2.甲醛明膠液

40%甲醛 2.5ml

明膠 0.5g

蒸餾水 至100ml

配制方法：將少許蒸餾水(約80ml)將明膠加熱溶解，待*溶解后，加入甲醛，zui后補充蒸餾水至100ml備用。用法同鉻礬明膠液。

3. APES液

APES 1ml

丙酮 50ml

配制方法：取APES 1ml，加丙酮50ml，充分攪拌均勻備用。將清潔的載玻片放入APES液中20～30秒后，取出，用丙酮液洗去多余的APES液，注意不要留有氣泡，晾干備用。經該方法處理的玻片具有良好的防脫片能力。

4.多聚賴氨酸液

多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine) 1ml

蒸餾水 10ml

配制方法：取市售Poly-L-Lysine 1ml，加入蒸餾水10ml，置塑料容器中，將清潔的玻片放入該液中5分鐘，取出放置無塵干燥箱中晾干備用或60oC干燥箱烤干備用。所需容器不能用玻璃制品。經該方法處理的玻片具有很強的粘合能力。但價格較APES貴得多。

五、封固劑

1. 緩沖甘油

純甘油(分析純) 20ml

0.5M碳酸緩沖液(PH9.5) 20ml

配制方法：取純甘油20ml，加入碳酸緩沖液20ml，充分混合，待氣泡*消失后，即可使用。

2. 甘油-TBS(PBS)

純甘油 90ml

0.01MTBS 10ml

純甘油 75ml

0.01MPBS 25ml

配制方法：按上述比例將甘油和TBS(PBS)充分混合后，置4oC靜置，待氣泡*消失后，即可使用。

3. 甘油明膠

明膠 10g

甘油 10ml

蒸餾水 100ml

少許

配制方法：稱取10g明膠于溫熱(40oC)的蒸餾水中，充分溶解后過濾，再加入12ml甘油混合均勻。少許是為了防腐。

4. 液體石蠟

液體石蠟因含雜質少，很少引起非特異性熒光，故常用于免疫熒光時標本的封固。

5.DPX

Distrene 10g

酞酸二丁酯 5ml

二甲苯 35ml

DPX為中性封固劑，用于多種染色方法均不易褪色，但使組織收縮較明顯，故應盡量使其為均勻的一薄層。

六、 復染劑

1. Mayer氏蘇木素

配制方法詳見*篇第四章第四節。

2. 甲基綠

甲基綠 2g

蒸餾水 100ml

復染后水洗數次，常規脫水封片。

3. 核固紅

核固紅 0.1g

硫酸鋁 15g

蒸餾水 100ml

配制方法：將核固紅溶入15%硫酸鋁水溶液中，加熱溶解，冷卻過濾后備用。復染后用流水沖洗數分鐘后，常規脫水封片。