士鋒生物植物原生質體的制備

時間：2014-7-30閱讀：1212

一、實驗目的
原生質體是指植物細胞去掉細胞壁的裸露部分。它在培養條件下，①具有再生細胞壁，進行連續的細胞分裂并再生成完整植株的能力；②具有攝取外源大分子、細胞器，以及細菌，病毒的能力，因此是進行遺傳操作，基因轉移的好材料；③通過同種和異種植物的原生質體融合，可產生異核體，實現體細胞雜交，培育出新品種。通過此實驗，要求初步掌握原生質體分離和培養的基本操作技術和方法。
二、實驗原理
去掉植物細胞壁的方法可以是機械的人工操作，也可以利用酶解法。較早利用機械法制備原生質體的*Klercker（1892），直到1960年英國科學家Cocking才*次用酶法大量制備原生質體。本實驗以植物的葉肉組織為材料，利用纖維素酶和果膠酶來消化細胞壁，分離細胞。
三、實驗用品
器具：顯微鏡、離心機、離心管、剪刀（2）、鑷子（2）、吸管、小培養皿、載片、蓋片。
試劑：0.16mol/L CaCI.2.H2O、20%蔗糖液、酶解液
材料：油菜或菠菜或煙草
四、實驗方法步驟
1、取材根據實驗目的和條件選取不同的材料
2、分離原生質體
① 撕葉下表皮
② 酶解將撕去下表皮的葉片剪成小塊，放在盛有5mL酶液的小培養皿中，讓去除下表皮的一面接觸酶液，輔滿一層，在25~28℃下酶解60~90分鐘
3、收集純化
（1）用吸管將酶解液吸至5mL離心管中，以600rpm離心5分鐘以上，使原生質體沉降
（2）將上清（酶解液）回收，剩下原生質體及殘渣于管底
（3）加氯化鈣液約2mL，輕輕吹打均勻
（4）用注射器向離心管底部緩緩注入蔗糖約2—3mL，出現下部蔗糖液，上部原生質體懸浮液
（5）以600rpm離心10分鐘，在兩液相之間出現一條綠色帶，便是純凈的原生質體
4、觀察或培養
取少許原生質體于載片上，蓋片觀察其形態，或者將原生質體接種在培養基上進行培養，再生植株
五、實驗報告
1、簡述植物原生質體制備的方法步驟；
2、按鏡下觀察繪制原生質體。

士鋒生物植物原生質體的制備

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