SSR簡單序列重復標記(Simple sequence repeat, 簡稱SSR標記),也叫微衛星序列重復,是由一類由幾個核苷酸(1-5個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列,長度較短,廣泛分布在染色體上。由于重復單位的次數的不同或重復程度的不*相同,造成了SSR長度的高度變異性,由此而產生SSR標記或SSLP標記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同,但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列,因此可以用微衛星區域特定順序設計成對引物,通過PCR技術,經聚丙烯酰胺凝膠電泳,即可顯示SSR位點在不同個體間的多態性。
優點:(1)標記數量豐富,具有較多的等位變異,廣泛分布于各條染色體上;
(2)是共顯性標記,呈孟德爾遺傳;
(3)技術重復性好,易于操作,結果可靠。
缺點:開發此類標記需要預先得知標記兩端的序列信息,而且引物合成費用較高。
操作程序:
取葉片→磨樣→提取DNA→pcr擴增→電泳檢測→染色→讀帶標記
1、DNA提取
按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法(`Cetyl triethyl ammonium bromide)并略加改進的程序進行,具體步驟如下:
① 成熟期取葉片加液氮研磨成粉末狀,轉入1.5ml離心管中,-20℃冰箱保存;
② 加入600ul 65℃的2×CTAB混勻并置于65℃水浴中保溫30~60分鐘;
③ 取出,冷卻,上下搖勻后,加入600微升24:1的氯仿異戊醇;
④ 12000轉/分鐘離心10分鐘,取上清液于另一個1.5ml的離心管中;
⑤ 加異丙醇,12000轉/分鐘離心10分鐘,倒掉上清液;
⑥ 干后用的灑精清洗,干后加適量TE
2、PCR擴增
模板DNA的濃度大約25ng/ul,擴增反應體系為20ul。具體如下:
Sterile ddH2O 11ul
PCR Buffer 3ul
dNTP-mix 0.5ul
Primer1 1ul
Primer2 1ul
Taq polymerase 0.5ul(2U/μL)
DNA 3ul
PCR擴增程序為:(2h30min)
① 預變性:94℃,5分鐘;
② 變 性:94℃,40秒;
③ 退 火:55℃ 40秒;
④ 延 伸:72℃,1分鐘;
⑤ 循 環:從2到4共38個循環;
⑥ 72℃下zui后延伸5分鐘;4℃ 5min,擴增產物置于4℃的冰箱保存。
3、擴增產物的電泳分離
制膠→灌膠→上樣→電泳
擴增產物用8%的聚丙烯酰胺變性膠電泳分離,步驟如下:
① 準備電極液(1×TBE);
② 將梳子撥出,并迅速用電極液沖洗膠面;
③ 不預電泳;
④ 點樣,電泳220v;
⑤ 拆板,并及時將內板、邊條及梳子洗凈。
4、凝膠染色
① 固定:10%醋酸,5分鐘;
② 染色:10分鐘;
③ 漂洗:dH2O,5~10秒;
④ Na2S2O3 1min
⑤ 顯色:甲醛- NaOH,直到滿意為止;
⑥ 漂洗:dH2O,2分鐘。
5、自封帶封膠,讀帶標記,數碼照相攝像,室溫風干。