原代細胞培養和死活細胞鑒別血球計數實驗
【實驗目的】
1、 了解原代細胞培養的基本方法及操作過程。
2、 學習細胞計數、營養液的配制等，初步掌握無菌操作方法。
3、了解細胞損傷的過程及死活細胞的鑒定方法。
【實驗原理】
（一） 細胞原代培養
原代細胞培養是指直接從動物體內獲取的細胞、組織和器官，經體外培養后，直到*次傳代為止。這種培養，首先用無菌操作的方法，從動物體內取出所需的組織（或器官），經消化，分解成單個游離細胞，在人工培養下，使其不斷的生長及繁殖。
細胞培養是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹的實驗技術。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必須的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環境酸堿度與滲透壓的調節。二是嚴格控制無菌條件。
（二） 細胞死活鑒定
在顯微鏡下活細胞細胞膜完整、立體感強，胞質透明度好，顆粒狀物質少;死細胞膜破裂，無立體感，細胞通透性差，有顆粒狀物質、空泡。
培養好的細胞培養液顏色呈土黃色，透明度好，不渾濁，發亮，有渾濁可能是污染初期或細胞太多。
染色排除法是生物研究中判斷細胞活性的一種常用方法，簡便，易于操作實驗是利用了死活細胞在生理機能和性質上的差異來進行的。原理：因為活細胞的細胞膜具有選擇透過性，細胞不需要的物質通常不能進入細胞，染色劑中如臺盼藍就不能進入細胞，因此用該染色劑處理細胞后，細胞不會被染色，由于死細胞的細胞膜是全透性的，因此臺盼藍能進入死細胞，從而可以使死細胞染色。依此染色便可以判斷細胞的活性。
活細胞必需通過控制物質進出細胞膜來保持內部生理環境的穩定性。細胞死后，細胞膜通透性發生改變，原先不能進入細胞的物質也能夠進入細胞。常見的細胞燃料有：中性紅、臺盼藍、甲基藍、美藍、熒光素雙醋酸酯等。臺盤藍染料正常情況下被活細胞阻攔在細胞膜外，只有細胞膜受損或者細胞死亡后，才能進入細胞，從而與解體的DNA結合，使其著色，因此，活細胞一般不能被臺盤藍染色，而死細胞會被染成藍色。通過顯微鏡很容易就能識別出死亡被染色的細胞，并可用細胞計數板進行計數。伊紅和蘇木精是zui常用的細胞染色劑。伊紅在很多生物技術中都有應用。伊紅有自發熒光特性。懸液中細胞的計數，往往采用*。
熒光排除法 生活力強的細胞能發出強烈的黃綠色熒光;生活力的細胞發出熒光也較弱;死亡細胞無熒光。
【實驗器材】
解剖剪，解剖鑷，棉球，培養皿，酒精燈，75%酒精，移液槍，無菌操作臺，培養箱，正置光學顯微鏡，倒置光學顯微鏡，吸管，解剖盤，滴管，離心管，離心機，注射器，塑料培養皿，載玻片，蓋玻片，*等。
【實驗材料】
小鼠1只，細胞培養液（含生長因子），Trypen Blue染液，PBS緩沖液
【實驗步驟】
（一） 細胞的原代培養
1. 取材：
取小鼠一只，采用斷頭法處死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出轉入超凈工作臺內的解剖盤中，無菌操作打開腹腔，取出其脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，轉入無菌培養皿中待用。
2. 分離脾細胞：
用滴管向培養皿中注入30滴PBS緩沖液，再用’L’型針頭注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾臟，注射時沿長軸注射。然后再用針頭在脾臟上扎眼，并用’L’型針頭輕輕刮出脾細胞。在均勻吹勻脾臟細胞。
吸取上述分離的單個脾細胞懸液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min離心5min。
3. 培養脾細胞：
取塑料培養皿一套，用移液槍吸取培養液2mL加入塑料皿中，并將皿標記待用。取離心后的Eppendorf管，棄去上清液，用移液槍（200ul）吸取塑料皿中的培養液400ul加入棄去上清的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞，吸取200ul脾細胞懸液接種于上述塑料皿中，混勻后放入37°C，5%CO2的培養箱中培養。
（二） 細胞死活鑒定及計數
1. 試劑配制：用生理鹽水配成4%Tyrpen Blue染液，備用。
2. 染色計數：
取0.5mL細胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液?；旌?。2min后將細胞放在*上觀察死活情況。
3. 計數：
在10x10倍的顯微鏡下觀察，計算*的中間方格四角和中間5個小方格的細胞數量。包括細胞總數與死細胞數量。壓線者計上不計下，計左不計右。
4. 計算細胞活力：
根據公式：
活細胞率（%）={（細胞總數—死細胞數）細胞總數}*100%
【實驗結果】
Tyrpen Blue染液，活細胞不會被染色而呈無色，死細胞會被其染色而呈藍色。
顯微鏡下觀察結果：
表格
計算結果：
死細胞 個ml
活細胞 ml
活細胞率 %
死細胞率 %
細胞活力 %
【注意事項】
1、嚴格進行動物消毒，需用75%酒精消毒。
2、嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質污染。
3、吸取液體前，瓶口和吸管硬行火焰消毒;吸取液體時，避免碰撞。
4、離心管入臺前，管口、管壁應消毒。
5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關閉工作窗。
6、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。
【分析總結】
染色時間過長，或觀察時間過長都會導致染色試劑將細胞殺死，使細胞活力驟降。
