原位雜交實驗步驟

一質粒制備
1質粒的轉化和擴增
1.1制備XL1-Blue感受態細菌
1．取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mlLB培養基的錐形瓶中，37℃、100rpm培養4h，離心，倒置，以冰冷的0.1mol／LCaCl_2重懸細菌，冰浴30min，離心，棄上清，倒置，再加4ml（含15％甘油）冰冷的CaCl2重懸細菌，分裝（200μ／tube），-80℃保存。
2．轉化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態菌中。
3．輕輕搖勻，冰浴30min。
4．42℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5．加入LB培養液（無氨芐青霉素）0.8ml，在37℃，100轉／min水浴孵育60min。
6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上（涂有X-Gal（20mg／ml）-IPTG（200mg／ml）的LB-氨芐青霉素50mg／ml,1μl／ml培養基），待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培養12-16h。
1.2鑒定和挑選含重組質粒的菌落
1．用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10ml含氨芐青霉素的LB培養液的離心管中，于37℃，200轉／分培養2h，取1ml之一Eppendorf離心管，加50μl10mmol／LEDTA（pH8.0）。
2．加入50μl新配置的0.2mol／LNaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振蕩30秒。
3．在70℃溫育5min，然后冷卻到室溫。
4．加1.5μ14mol／LKCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。
5．12000g，4℃離以3min，以除去細菌碎片。
6．制備1％的瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg／ml），取50μl上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒壓50V，進行電泳。
7．當溴酚蘭遷移到凝膠全長的2／3-3／4時，停止電泳，在紫外燈下檢查質粒DNA分于量的大小是否與轉入質粒相符。
1.3質粒的擴增和純化
1．用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30mlLB-氨芐青霉素（50μg／ml）培養液的聚丙烯管中，于37℃，200轉／分培養3h。
2．將菌液轉入含70mlLB-氨芐青霉素培養液的250ml錐形瓶中，37℃，200轉／分培養過夜（12-16h），細菌渾濁。
3.菌液中加入氯霉素液（34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，終濃度為170μ／ml）。37℃，200轉／分培養12-16h。
4.將培養的細菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4℃離,th,15min，沉淀細菌。
5.棄凈上清夜，用2ml預冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5min
6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃動10秒，顛倒數次后，于室溫靜置10min。
7.加入預冷的溶液III3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10min，出現白色絮狀沉淀。
8．6000rpm，4℃離心15min，保留上清。
9．將上清（若帶細菌殘片，則再次離心）移入另一50ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10min。（或-20℃4h，或4℃過夜，可便核酸沉淀）
10.12000rpm，4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。
11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。
12．用500μlTE（pH8.0）溶解核酸沉淀，轉移至1.5mlEppendorf管中。
13．加入用冰預冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000rpm，4℃離心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。
15.12000rpm,4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。
16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。
17.400μl含無DNA酶的RNA酶（20μg/ml）的TE緩沖液（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉移到另－1.5mlEppendorf管中，室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。
18．加入400μl13％（v／v）的PEG8000-NaCl（1.6mol／L），混勻，4℃12000rpm離心5min以回收質粒DNA，棄去上清。
19．加入400μlTE緩沖液（pH8.O）溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、和氯仿各抽提一次。
20．將水相（上清）移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1體積（約50μ13M的醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積（大約1ml）的無水乙醇，充分混勻后于4℃放置30min。
21．于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質粒DNA。盡可能棄去上清，敞開管口，置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發殆盡。
22．加入400μl處于4℃的70％乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4℃12000rpm離心2min。
23．吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇*揮發。
24．用100μlTE緩沖液（pH8.0）溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀釋后，測定其OD260、OD280，以確定質粒DNA的純度和濃度（OD260／OD280>1.8。OD260／OD280對DNA而言其值大約為
1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質污染。；DNA濃度=OD260X0.05X稀釋倍數（μg／μl）。
26．質粒DNA溶液于-20℃保存待用。
二、cRNA探針的標記
1．將質粒DNA，用相應的限制性內切酶線性化，通過瓊脂糖凝膠電泳以確保*線性化。
2．線性化后的DNA按“質粒的純化”步驟19-24進行純化，作為cRNA探針標記的模板，用相應的RNA聚合酶合成地高辛標記的反義和正義RNA探針。
3．進行體外轉錄，步驟如下：
4．在冰上將各試劑加入一1.5ml無RNA酶的Eppendorf管中。DEPC處理的三蒸水8μl
質粒DNA模板0.05μg／μl 1μl
10xNTP地高辛標記混合物 1x 2μl
0.1MDTT溶液 10mM 2μl
5x轉錄緩沖液1x 4μl
RNAse抑制劑 2U／μl1μl
RNA聚合酶 2U/μl 2μl
反應體系總體積 20μl
5．加入上述各試劑后，混勻，簡短離心后在37℃孵育2h。
6．加入2μl無RNA酶的DNA酶I（10U／μ1），37℃孵育15min降解模板DNA。
7．加入0.2MEDTA（pH8.0）溶液2μl終止反應。
8．加入2.5μl的4MLicl和7.5μl冷的無水乙醇，混勻，-20℃放置2h。
9．12000g下離以15min，棄上清，小心地用50μl冷的70％乙醇洗滌沉淀。
10．室溫下稍干燥，溶于100μ1DEPC處理過的三蒸水中，混勻分裝，-20℃下保持備用。
三、原位雜交
3.1冰凍切片與雜交前預處理
1．將子宮樣品從-80℃取出，用OCT包埋，在-23℃（切片機腔體溫度）平衡至少30min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10μm厚的連續組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸（1mg／m1）的玻片上（玻片預先經180℃干烤6小時），保存于-70℃冰柜備用。
2．冰凍切片經室溫干燥10min后，在4％的多聚甲醛-PBS（pH7.4）固定l0min。
3．活躍的DEPC-PBS（未高壓的0.1％DEPC-1XPBS溶液）洗2次，每次5min。
4．在0.2M的鹽酸作用中作用10min后，重復步驟4）。
5．在切片上滴加蛋白酶K（0.1μg／m1），37℃孵育15min，重復步驟4）。
6．經0.1MTEA（三乙醇胺）作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1MTEA（乙酸酐／三乙醇胺，pH8.0）中乙?；?0min。（在大多數實驗中，步驟4，5，6省略）
7．5xSSC中平衡15min。
3.2雜交
8．在脫水后的玻片上滴加預雜交液（約100μl／玻片），置于放有濕盒液（50％甲酰胺v／v；0.3MNaCl；1MmEDTA；10mMTris-Cl，pH8.O）的濕盒中，55～58℃下的烘箱中預雜交2h。
9．甩掉預雜交液，地高辛標記的反義或正義cRNA探針（濃度1-2ng／μl）經70℃變性1O分鐘，置冰上1min，玻片上滴加預雜交液（約60μl／玻片），覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48～58℃下雜交18-30h。
3.3雜交后處理
10．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52℃預熱的5×SSC洗30min。
11．在無DNA的RNA酶A（20μg／ml）溶液中37℃下孵育30min。
12．分別依次用52℃預熱的2XSSC，1XSSC和O.1XSSC洗2次，每次30min。
3.4雜交信號檢測
13．在緩沖液A（0.1MTris-HC1pH7.5，0.15MNaC1）中平衡5min。
14．在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體（1：500～1:2000稀釋于含0.5％阻斷液的緩沖液A中），室溫反應2h。
15．用緩沖液A洗2次，每次15min。
16．在緩沖液B（0.1MTris-HCl；0.1MNaCl；0.05MMgCl_2，pH9.5）中平衡5min。
17．硝基四氮唑藍（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸鹽（BCIP）溶于緩沖液B中，每ml緩沖液B含有4.5μ1NBT和3.5μ1BCIP。在玻片上滴加混合染液在濕盒中顯色過夜。
18．充分顯色后，用EDTA（1mMEDTA，pH8.0）洗15min終止反應。
19．在95％乙醇中洗lh以除去非特異的背景。
20．用蒸餾水洗15min除去可能存在的結晶體。
21．脫水、透明，用中性樹膠封片。
22．充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。