間充質干細胞的傳代培養

試劑和材料：
1. *培養基：α-MEM：α-*基礎培養基，含*，無核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-* 2mmol/L、經FBS雜交瘤純化，非熱滅活、*100U/ml、*100μg/ml。過濾除菌。儲存于4℃，不超過2周；
2. PBSA；
3. */EDTA；
4. 聚丙烯離心管，15ml和50ml；
5. 塑料組織培養皿，直徑15cm；
6. 塑料微量移液器槍頭，10—1000μl；
7. 0.85%臺盼藍鹽溶液；
8. 微量移液器；
9. 改良的Neubauer*

實驗方法：
1. 在培養的MSCs細胞中小的、貼壁、紡錘形的成纖維細胞樣細胞匯合至60%時，對其進行處理。如果單層細胞稀疏，則進行繼續潤洗和更換培養基；
2. 按如下步驟消化單層細胞；
（1） 用20ml預熱的PBSA潤洗單層細胞后，加入5ml*/EDTA；
（2） 將培養皿置于37℃ 2min，在10×放大倍數視野下觀察單層細胞。貼壁細胞應正從塑料瓶上脫落；
（3） 將培養皿置于37℃ 2min，再次觀察。重復觀察直至90%的MSCs已從培養瓶中脫落下來；
（4） 加入5mlCCM，將10ml懸液移至15ml離心管中，500g離心10min；
（5） 離心完畢，棄去上清，每管用1—2ml預熱的PBSA重懸沉淀。如有必要，混合多管細胞懸液只進行一次細胞計數；
3. 取10μl細胞懸液加到10μl臺盼藍中，用*進行計數。合適的細胞懸液濃度為（2—5）×105個細胞/ml，存活率需高于80%。*消化后用于傳代的早期培養物懸液，亦可進行集落形成單位（CFU）測定、凍存或分化測定；
4. 將細胞以50—100個細胞/cm的密度接種到培養皿中，保持低密度以保證快速的自我更新和多潛能特性。用預熱CMM以7×103（zui終濃度為50個細胞/cm2）到1×104（zui終濃度為100個細胞/cm2）的密度重懸MSCs；
5. 預備適當數量的15cm培養皿，加入25ml預熱的CMM；
6. 接種1ml步驟2和3所得的細胞懸液。來回滑動平皿（勿打圈）使細胞分布均勻。培養皿置于培養箱中，標記為一代細胞；
7. 培養2—3天后，觀察并評價形態。MSCs應為小的、紡錘體形狀，頻繁折光的雙聯體。此為培養良好的MSCs；
8. 從培養皿中吸出培養基，用20ml預熱的PBSA潤洗，加入25ml預熱的新鮮CMM；
9. 每次傳代時所需的培養皿數量取決于可以接種的細胞數量。方案中的上述體積適用于MSCs接種單個15cm培養皿。如有需要可按此例擴大以接種多個培養皿；