利用鹽酸克倫特羅試劑盒,對豬肉組織中殘留的鹽酸克倫特羅經抽提、競爭后,用酶標儀進行檢測分析。此法較適用于現場檢驗,檢測速度快、靈敏度高,是保證肉品衛生安全的較好監控方法

 酶聯免疫吸附法是目前*的檢測方法。ELISA 檢測方法有雙抗體夾心法測抗原、間接法測抗體、競爭法測抗體等。該文是利用酶聯免疫吸附法中的競爭法測抗體,其原理是利用多克隆抗體既能與鹽酸克倫特羅結合,也能與包被抗原結合。這些包被抗原被固定在酶標板孔壁上,當樣品中含有瘦肉精時,它與包被抗原競爭結合抗體中有*的結合位點。由于每一個孔中抗體的結合位點數相同,當樣品中瘦肉精濃度低時,就有更多抗體的位點與包被抗原結合,更多的抗體被固定在酶標板壁上,就會與更多的酶標二抗結合,所以結果就呈現深蘭色。相反,樣品的瘦肉精濃度高,結果就呈現淺蘭色。加入終止液后,蘭色相應變成黃色,然后用酶標儀進行測定。利用競爭酶聯免疫吸附法檢測瘦肉精,具有速度快,靈敏度高的特點,適用于現場檢測,對以后瘦肉精檢測工作的發展具有指導作用。

　　1 　實驗材料與方法

　　1.1 　原料的準備

　　抽取具有一定批量的有代表性的無皮豬肉,剔除雜質、脂肪。將精肉用剪切均質勻漿機 混合均勻,放置冰箱冷凍備用。取搗碎的樣品5g ,加入25mL ,50mmolHCl 振動1.5h ,以達到均質。稱取5g均質物(相當于1g 肝臟或肌肉),加入離心管中,10000r/min 離心15min。取上清液至另一個離心管中, 加1mol NaOH 300ul , 混合15min。加入4mL ,500mmol KH2PO4 (pH3.0),迅速混勻置于4攝氏度的冰箱內保存至少1.5h。10000 r/min 離心15min ,分離上清液。

     1.2 　試劑    鹽酸克倫特羅—酶聯免疫試劑

     1.3　 MK3 FC酶標儀、Wellwash 4mk2洗板機、 OMNI系列 多樣品prep ，高能混合Mixer, Macro ，手持TH剪切均質勻漿機  Finnpipette單道 8，12道微量加樣器 （由大陸代理商 平利洋公司友情提供）  國產離心機  國產電熱恒溫水浴鍋。

     1.4 　方法

     1.4.1 　洗板　所有試劑回溫至室溫。將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10 倍。將酶聯免疫板取出,放在室溫下平衡5min。每孔加入300uL 洗液,放置1min ,再甩掉洗滌液,重復3 次,將板內殘留洗滌液在吸水紙上甩干。

　　1.4.2 　競爭　試劑盒中的抗體按1∶1000 倍稀釋。加樣時在板上按1 到3 的順序加入標樣,每孔100uL ,重復兩次,其它孔加入待測樣品,每孔100uL 抗體,注意加入抗體時不要讓槍頭沾染孔里的樣品與標準樣,然后將酶標板放入濕盒里,在37攝氏度下競爭30min。

　　1.4.3 　加二抗　試劑盒中的二抗標記酶按1 :1000 稀釋。在酶聯板上每孔加200μL 配制好的二抗標記酶,將其放入濕盒,置37攝氏度、30min。

　　1.4.4 　加底物顯色　取底物A、底物B 按等體積混勻,在酶標板上每孔加200μL 配好的底物顯色板顯色,顯色后每孔加入50uL 的終止液終止反應。在酶標儀上測定各標準樣和各樣品450nm 處的光密度(OD)值,用瘦肉精標準液200ng/mL 孔作為0孔。

　　2 　討論

　　2.1 　試劑盒的貯存  試劑盒在4攝氏度貯存?？贵w和酶標二抗(IGg-HRP)在常溫下容易變性,須冷凍保存,使用時直接拿出按比例稀釋。

　　2.2 　加樣  實驗中有3 次加樣步驟,即加標本、酶結合物和底物。加樣時應將所加物用微量加樣器加在ELISA板孔的底部,可用左手扶住微量加樣器的中部,避免加在孔壁上部,并防止濺出和產生氣泡,導致實驗誤差。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器,使加液過程迅速完成。

　　2.3 　保溫  在實驗中有兩次抗原抗體反應,即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育(incubation)或孵育。因為ELISA 屬固相免疫測定,抗原、抗體的結合只在固相表面上發生,加入板孔中的標本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。溫育的溫度通常是37攝氏度,也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。兩次抗原抗體反應一般在37攝氏度經1～2h ,產物的生成可達。為加速反應,可提高反應的溫度,但zui高不要超過43攝氏度。保溫的方式采用水浴,將板置于不銹鋼電熱恒溫水浴鍋中,注意可將ELISA 板置于水浴箱中,ELISA 板底應貼著水面,使溫度迅速平衡。為避免蒸發,板一次不宜多于兩塊板同時測定。

　　2.4 洗滌  洗滌在ELISA 法過程中是很關鍵的一步。ELISA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。如果洗板被污染或洗滌用水被游離的酶標記物污染、洗滌次數不夠或注水量不足、洗板后間隔時間太久致使板孔干燥等都會直接影響檢測的zui終結果,嚴重者實驗不產生顏色致使實驗失敗。

　　2.5 顯色和比色  顯色是ELISA 中的zui后一步溫育反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。酸性終止液H2SO4 會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗,需先將板置于標準96 孔的座架中,才可進行比色。并在加底物液顯色前將軟板邊緣剪凈,以使軟板