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整個組織(或者一部分組織,比如1克,具體需要考慮組織的大小和所含藥物量及方法的檢測限),置于適當的容器中(比如試管,2ml 15ml),加入適當體積的適當溶劑(體積可采用1:2,即1g組織用2ml溶劑,至于溶劑的種類,可選擇水、甲醇、乙腈等,具體需要考慮藥物的溶解性),然后以 18000rpm的OmniTH Prep多樣品剪切勻漿機 或 6m/s Omni Bead Ruptor 24多樣品研磨珠進行勻漿 (時間大約1min),直至獲得均一的勻漿液,然后超聲5min(為充分溶出藥物,但須考慮藥物的穩定性)、3500g離心5min,分取上清液。然后按照與血漿的預處理方法繼續處理進樣測定即可。
上述操作的主要目的是將組織細胞中的藥物*溶解出來,從而能夠測定全部的藥物濃度。因此如果采用細胞破碎儀OMNI Sonic Ruptor 250和Sonic Ruptor 400也可以。
但在操作中需要考慮藥物的穩定性。畢竟高速勻漿會產熱導致藥物降解。
勻漿時保持低溫,因為30度左右代謝酶會產生活性,可能會影響測定結果。
勻漿的目的是什么?應該是測里面的某種成分的含量或活性吧,或者其他目的。冰水浴的目的是什么?防止活性成分分解或滅活。如果你要測的東西穩定性做夠好,沒必要冰水浴
組織勻漿的時候需要在冰上操作,加蛋白酶抑制劑
盡量在冰上,溫度當然是低些,以防蛋白降解還怕尿素分解,以致于氨甲基化修飾蛋白,影響后面的質譜鑒定
控制在低溫 不要連續勻漿可以每勻漿10秒 就把勻漿的容器放置于冰水混合物中降溫,然后再勻漿,這樣可以減少對目的物的損傷
操作步驟:參照《蛋白質技術手冊》
1、用*或*迅速將清洗的組織分離成適宜的小塊,如1cm^3
2、每體積濕重組織通常加3~5倍體積預冷的勻漿緩沖液至勻漿容器內
3、制備勻漿:1)手動的玻璃勻漿器勻漿10-20次。2)剪切式組織勻漿均質以10000-28000rpm的速度,高速勻漿3次,每次10秒,次間暫停幾秒。3) 24多樣品研磨珠均質儀以線速度6.5m/s,高速勻漿3次, 每次15秒 , 次間間隔10秒。
4、離心去上清,轉速可參照 3,000. rpm/15 minutes/4'C
5組織勻漿經提取液提取后得到的應是組織細胞的總蛋白質
注意事項:
避免血液影響:
1 充分放血 (找到頸動脈或股動脈,剪斷,放血會比較充分)。
2 對于血流較豐富的器官,比如肝臟,可用生理鹽水從肝門靜脈灌流沖洗。
3勻漿過程應注意維持低溫,可外置冰水浴 Omni公司 兩款設備可選配冰槽 和Cryo 24多樣品研磨珠均質儀冷卻單元
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