中性dan白酶(NPT)試劑盒,微板法

中性dan白酶(NPT)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 中性*白酶（Neutral protease, NPT）試劑盒說明書 （貨號：WS4140W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： 蛋白酶廣泛存在于動物內臟、植物莖葉、果實和微生物中，中性蛋*酶（NPT）是在中性條件下將酪 蛋白水解產生酪*酸；酪*酸與福林酚在堿性條件下反應生成藍色化合物；該藍色物質在 680nm 有特征 吸收峰，進而得中性*白酶活性， 由于底物酪蛋白自身含有多種氨基酸，所以在檢測過程中必須設置帶有底物酪蛋白的對照，以扣除有 干擾的背景值，排除假陽性。 二、測試盒組成和配制： 試劑名稱 規格試劑名稱 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×2 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入試管底部， 每瓶加入 3mL 試劑二 90℃加熱攪拌至分散， 再加 12mL 提取液攪拌至溶解，最后再加提 取液定容至 30mL,繼續攪拌至全部溶解；配 置完的試劑 4℃保存，三天內用完。 試劑二 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑三 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑四 液體 40mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻 試劑五 液體 10mL×1 棕色瓶 4℃保存 現用現配，用前甩幾下或 4℃離心使試劑落入 試管底部，再加 20mL 蒸餾水， 4℃保存， 一星期內用完。 標準品 粉體 mg×1 支 EP 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 【注】：試劑一若在磁力攪拌器（帶溫控）上溶解，可用錫箔紙或保鮮膜蓋住燒杯，以免溶解過程中水分蒸發過快。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、蒸餾水 四、中性*白酶（NPT）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：測定管和對照管分別取約 0.1g 組織（水分充足的果實約 0.5g），加入 1mL 提 取液，進行冰浴勻漿；12000rpm，4℃離心 15min；取上清液待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌/真菌樣本：測定管和對照管分別取約 500 萬細胞加入 1mL 提取液，冰浴超聲波破 碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；12000rpm，4℃離心 15min； 取上清液待測。 【注】：若增加樣本量，按細菌或細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 比例進行提取 ③ 液體樣本：澄清液體直接檢測；若渾濁則 12000rpm，4℃離心 15min；上清待測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 680nm，配制好的試劑一需預先 50℃水浴 10min。 ② 在 2mL 離心管中依次加入下列試劑培養： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 500 500 試劑一 500 40℃振蕩培養 10min，同時，余下的試劑一須單獨 40℃振蕩培養 10min本試劑盒僅供科研使用 2 上歩單獨 40℃培養的試劑一 500 試劑三 500 500 混勻，室溫靜置 10min，1500rpm（須準確），4℃離心 10min，上清液待用 ③ 顯色反應：在 EP 管中依次加入： 上清液 250 250 試劑四 375 375 試劑五 250 250 40℃水浴 20min，取 200μL 澄清液（若渾濁，可 1500rpm 離心 10min） 至 96 孔板中，于 680nm 讀取吸光值 A，△A=A 測定管-A 對照管。 【注】1.若△A 在零附近徘徊，可以加大樣本量（如增加到 0.2g），或延長 40℃培養時間（如增加至 30min），或在顯色反應階段加大上清液體積（如，增加至 350μL，則試劑五相應減少），則改 變后的樣本質量 W，反應時間 T 和顯色步驟中的上清液體積 V1 需代入公式重新計算。 2.若測定管的 A 值大于 1.5，可減少樣本取樣量（如減少到 0.05g），或把上清液用蒸餾水進行稀 釋，稀釋倍數 D 代入公式參與計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.0626x + 0.0011，x 是標準品質量（μg），y 是ΔA。 2、按照蛋白濃度計算： 活性單位定義：40℃每毫克蛋白每分鐘催化水解產生 1μg 酪*酸為 1 個酶活單位。 NPT 活性(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0011)÷0.0626×(V3÷V2)÷(Cpr×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ÷Cpr×D 3、按照樣本質量計算： 活性單位定義：40℃每克樣品每分鐘催化水解產生 1μg 酪*酸為 1 個酶活單位。 NPT 活性(μg/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷(W×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ÷W×D 4、按照細胞數量計算： 活性單位定義：40℃每 104個細胞每分鐘催化水解產生 1μg 酪*酸為 1 個酶活單位。 NPT 活性(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷(細胞數量×V1÷V)÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011)÷細胞數量×D 5、按液體體積計算： 活性單位定義：40℃每毫升液體樣本每分鐘催化水解產生 1μg 酪*酸為 1 個酶活單位。 NPT 活性(μg/min/mL)=(ΔA-0.0011) ÷0.0626×(V3÷V2)÷V4÷T×D =19.2×(ΔA-0.0011) ×D V---提取液體積，1mL； V1---樣本體積，0.5mL； V2---顯色步驟上清液體積，0.25mL； V3---培養步驟總反應體積，1.5mL； V4---液體樣本，0.5mL； 酪*酸分子量---181.19； T---反應時間，10min； W---樣本質量，g； D---稀釋倍數，未稀釋即為 1； Cpr---粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白質含量測定試劑盒檢測。 附：標準曲線制作過程： 1 標準品母液（100μg/mL）：標準品溶于 100mL 的 0.1mol/L 鹽酸溶液中（兩天內用完且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度標準品：0, 4, 8, 12, 16, 20. μg/mL。也可根據實際來調整標準品濃度。 3 依據測定管的顯色反應階段加樣表依次加樣，根據結果即可制作標準曲線。