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南京億迅生物科技有限公司
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更新時間：2019-11-07 11:04:34瀏覽次數：448
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線粒體異檸檬酸脫氫酶(ICDHm)檢測試劑盒
測定原理
ICDHm催化NAD+ 還原生成NADH，導致340nm處光吸收上升。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：1mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1支，4℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑七：粉劑×1支，-20℃保存; 臨用前加入3mL雙蒸水充分混勻待用，用不完的試劑仍-20℃保存。
工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六轉移到試劑四中混合溶解待用。
ICDHm的提取
- 準確稱取約0.1g組織或收集約500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽研磨。
- 4 ℃ 600 g離心5min。
- 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心10min。
- 上清液即胞漿提取物，可用于測定可能從線粒體泄漏的ICDHm（此步可選做）。
- 在沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線粒體ICDHm活性測定。
測定步驟
- 調零
用蒸餾水于340nm處調零。
1）取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。
（2）取出比色皿，再依次加入60μL試劑七和80μL樣本，混勻；加入樣本的同時開始計時，立即記錄340nm處20s的吸光值A1，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）中準確反應2min，記錄340nm處2min20s時的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。
注意事項
1、測定過程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。
2、比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。
線粒體異檸檬酸脫氫酶(ICDHm)檢測試劑盒
