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T4 DNA 連接酶

描述：T4 DNA Ligase 可催化相鄰 DNA 鏈的 5’-P 末端和 3’-OH 末端以磷酸二酯鍵結合的反應，需 ATP 作輔酶，不僅 可以催化粘性末端之間或平滑末端之間的 DNA 的連接，也 可以催化 DNA 與 RNA 之間以及少數 RNA 之間的連接。可 應用于在粘性末端或平末端連接雙鏈 DNA 分子，也可應用 于修補雙鏈 DNA、RNA 或 DNA RNA 雜交體上的缺口。

組分

儲存：-20°C 可保存 2 年。
活性定義：16°C 反應 30 分鐘條件下，使 1pmol 的粘性末端
DNA 連接所需要的酶量定義為 1Unit。
失活：65°C，10 分鐘。
10×T4 Ligase Buffer：500 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mMMgCl2, 25mM DTT, 5mM ATP.
操作方法
1. 按以下組分配制反應體系
10×T4 Ligase Buffer 2 μl
載體 50 ng(0.2-1pmol)
插入片段 1-50 ng(0.2-10pmol)
T4 DNA Ligase(200 U/μl) 1 μl
ddH2O Up to 20 μl
注意：兩個片段的連接時，通常載體與插入片段的摩爾比為1:3（但該比例并非絕對嚴謹，在 1:1-1：10 范圍內均可獲得理想的實驗結果），提取根據片段大小與濃度，計算其摩爾濃度。
2. 如為粘末端連接反應， 22°C （16-37°C）連接 30min，連接產物直接用于轉化（或凍存于-20°C）。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。