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ssDNA/RNA環化連接酶

描述： ssDNA/RNA CircLigase 為熱穩定的 DNA/RNA 連接 酶，不依賴于 ATP，可催化單鏈 DNA 或單鏈 RNA 的分子內 環化。環化反應中，要求催化底物單鏈 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基團和 3’-OH 基團。對于大于 15nt 的單鏈底物，該酶 都能高效的連接。 

組分

活性定義：65°C 1h 條件下，催化 1pmol 5’-磷酸化的 ssDNA
底物環化，所需的酶量定義為 1Unit。
儲存：-20℃可保存 3 年。
反應實例
1. 按以下組分配制反應液
CircLigase (100 U/μl) 1 μl
5’磷酸化 ssDNA/RNA 10-100 pmol
10×CircLigase Buffer 2 μl
50mM MnCl2 1 μl
ddH2O Up to 20 ul
65°C 孵育 1h 進行環化反應。
2. 失活反應
反應結束后，可加入終濃度 10mM EDTA 終止反應。或采用
加熱方式 85℃ 10min 加熱失活。
使用注意事項：
(1) 環化底物 ssDNA 或 RNA 必須帶有 5’磷酸基團，3’端含有 OH。
(2) 環化體系中的 ATP 濃度高于 20μM 以上時會極大抑制環化效率，甚至導致環化失敗。因此建議底物為純化產物。
(3) 由于本酶提高了耐熱性，在 65℃條件下進行連接反應，在測試中 Betain 無益于連接效率提升。
(4) 本酶主要進行分子內環化連接，分子間的連接未檢測到。
(5) 本酶對 ssDNA 和 RNA 的環化效率高，多數情況下，90%以上的底物被環化。未被環化的 ssDNA 可通過加入 5U的 Exonuclease I，37°C 消化 15min 去除，以獲得高純度的環化 ssDNA。未環化的 ssRNA，將稍后給出去除方案。
(6) 本酶可以連接 15nt 以上的核苷酸，更長的產物連接參數，將稍后給出測試報告及 protocol。
(7) 對于連接底物量較少的實驗來講，推薦縮小體系，而不是減少酶的用量。在小體系實驗時注意體系的蒸發，可加入礦物油以防止蒸發。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。